抗创伤弧菌单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立及特性鉴定.pdf

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1、ISSNt007—8738细胞与分子免疫学杂志(ChinJCellMolImmuno1)2012，28(3279·论著·文章编号：1007—8738(2012)03—0279—03抗创伤弧菌单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立及特性鉴定付凯飞，马骢，郭建巍，乔媛媛，郝秀红，王大鹏(海军总医院检验科，北京100037)Preparationandcharacterizationof高。感染患者往往通过生食海产品或开放性伤口接触海水后发生侵袭性败血症，初期死亡率大于50％，monoclonalantibodyagainstVibrio如发生败血症性休克

2、死亡率将达到100％_1J，故对创vulnificus伤弧菌的快速诊断是救治的关键。目前，尚未见到创伤弧菌的快速诊断试剂盒问世，本实验通过杂交FUKai-fei，MACong，GUOJian—wei，QIAOYuan—瘤技术制备了针对创伤弧菌的单克隆抗体(mAb)，yuan，HAO-hong，WANGDa-peng旨在为进一步研制快速ELISA检测该菌的试剂盒提ClinicalLaboratory，NavyGeneralHospital，Beijing100037，China供重要的制剂。[Abstract]AlM：Topreparehig

3、h-performanceandspa-cificmonoclonaIantibody(mAb)againstr／ovulnificus1材料和方法andcarryoutcharacteriastion．METHODS：BALB／cmice1．1材料雌性BALB／c小鼠(8周龄)购于本院动物中心。wereimmunizedwith坳r／ovu~ificusprotein．andhybrido-标准创伤弧菌(菌株编号1．1758，为冷冻干燥粉末状)，购于macellsagainstr／ovu&ificuswereproducedbycells

4、ion中国科学院微生物研究所普通微生物保藏管理中心。野生型technique．ThetitersofmAbsagainstvvhAandcross-reac-tionbetweentheanti-whAmAbandotherotherimportant创伤弧菌、河流弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌及腐败西瓦菌marinebacteriawerescreenedbyELISAandWesternblot．均为本室自海水中分离、鉴定所得。whA基因原核表达系统RESULTS：Fivestrainsofhybridomawereobtained．Ide

5、nti-质粒：pET28a-vvhA由本课题组构建。RPMIi640培养基购于ficationresultindicatedthat5mAbshavefavourablespecifity北京天润善达生物技术公司。HT和HAT培养基为Gibco公andimmunoreactivity．CONCLUSIoN：SpecificmAbsa-司产品。(不)完全弗氏佐剂购自赛驰公司。聚乙二醇(PEGgainstbr／ovu~ificuswereproducedwhichprovidsanim-1500)购自Merck公司。HRP标记的羊抗鼠IgG、I

6、mmunoTy—po~antpreparationforestablishingrapid·-detectionkitofde·-pe鼠mAb分型试剂盒为Sigma公司产品。异丙基一1一硫代一tectingbr／ovulnificus．半乳糖苷(IPTG)购自Promega公司。Ni—NTA亲和层析材料[Keywords]Vibriovu~ificus；monoclonalantibody；hybri-由上海博亚生物科技有限公司提供。domatechnique1．2方法[摘要]目的：制备高效、特异的抗创伤弧菌的单克隆抗体1．2．1免疫原wh

7、A的制备及活性鉴定将pET28a—vvhA转(mAb)，并进行特性鉴定。方法：用创伤弧菌菌体蛋白抗原化E．coliBL21DE3感受态细胞，利用IPTG对其诱导whA的免疫小鼠，利用杂交瘤细胞融合技术，制备抗创伤弧菌的杂表达，并进行SDS-PAGE分析。将表达的vvhA用Ni-NTA亲交瘤细胞株。用ELISA法及Westernblot等筛选、鉴定其与创和层析柱纯化：先用NiSO处理NiTA介质，加入超声破碎后伤弧菌溶血素蛋白(vvhA)及其他重要海洋细菌的交叉反应性的BL21菌体蛋白，洗涤介质杂蛋白至无蛋白流出(考马斯亮和效价。结果：共获得

8、5株抗创伤弧菌的mAb，鉴定结果表蓝检测)，再用不同浓度缓冲液梯度洗脱介质，回收流出液明，5株mAb均具有良好的特异性和免疫反应性。结论：获(考马斯亮蓝检测)，对蛋白浓度适量的样