抗ICAM-1单克隆抗体的制备与特性鉴定.pdf

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1、1212ISSN1007—8738细胞与分子免疫学杂志(ChinJCellMolImmuno1)2011，27(11·论著·文章编号：1007—8738(2011)1l一1212—03抗ICAM一1单克隆抗体的制备与特性鉴定柴锦燕，方佩华，李宁，董升(天津医科大学总医院核医学科，天津300052)[摘要]目的：制备有生物学活性的抗人细胞问黏附分子．1HT培养液均为GIBCO公司产品；HEPES、二甲基亚砜(DM—(ICAM一1)单克隆抗体(mAb)并进行特性鉴定。方法：以纯SO)、秋水仙素、丙烯酰胺、十二烷基硫酸钠(SDS)、过硫酸品ICA

2、M．1为抗原免疫BALB／c小鼠4次。采用杂交瘤技术，铵、B巯基乙醇及硝酸纤维素膜，购自北京鼎国生物技术公经3次亚克隆筛选稳定分泌抗人ICAM-1mAb的杂交瘤细胞司。ProteinGSepharose4FastFlow购自美国GE公司。其他株。采用动物体内诱生的方法大量制备mAb。以proteinG对试剂均为进口分装或国产分析纯。其进行纯化后，用间接ELISA法测定mAb的效价并鉴定其Ig1．2方法亚类。用Westernblot鉴定mAb的特异性。结果：筛选出41．2．1动物免疫基础免疫共3次，首次免疫：将ICAM-1株可稳定分泌抗人IC

3、AM一1mAb的杂交瘤细胞株，分别命名抗原与弗氏完全佐剂，按1：1(v／v)的比例乳化后，每只小鼠为B9株、F1株、C11株和D6株。4株mAb的Ig亚类均为腹腔注射10g。首次免疫后，每隔3周免疫1次，第2、3IgG1。4株mAb培养上清的效价均为l：l000；腹水的效价B9次免疫：将ICAM一1抗原与弗氏不完全佐剂混合乳化后，每只株与196株为1：2x10，F1株与C11株为1：4×10。纯化后小鼠腹腔注射5g。第3次免疫后2周，由内眦静脉取血，mAb的蛋白浓度为1．2g／L，均可与ICAM-1特异性结合。结用间接ELISA法测定血清效

4、价，选择抗体效价较高的小鼠作论：成功制备出效价高、特异性良好的4株抗ICAM一1mAb，细胞融合用。于融合前3d，经小鼠尾静脉注射无佐剂抗原为进一步研究ICAM一1的生物学功能和临床应用奠定了基础。10p~g(O．1mL／只)。[关键词]细胞间黏附分子，1；单克隆抗体；杂交瘤技术1．2．2杂交瘤细胞的制备融合前24h，制备饲养细胞。由[中图分类号]R392．12[文献标识码]B加强免疫后小鼠的眼球放血，并分离血清供测定抗体用。无菌取出脾脏，收集脾细胞，与Sp2／O细胞在PEG1650作用下按5：1的比例进行细胞融合。然后加入含HAT的RPM

5、I1640细胞问黏附分子一1(intracellularadhesionmole完全培养液，接种于96孔板中，每孔0．1mL，置37％、50cule一1，ICAM-1)是细胞表面的一种单链糖蛋白，参mI／LCO温箱中培养。在融合后7d内用HAT培养液，与抗原识别、补体结合及细胞黏附功能。可溶性细7～14d改用HT培养液，14d后换用普通的完全培养液即胞间黏附分子一1(solubleintracellularadhesionmole．可。融合后10d左右，在大部分培养孔中的细胞生长至孔底cule一1，sICAM．1)为细胞表面ICAM一1脱落

6、形成⋯，面积的1／3—1／2时，用间接ELISA法检测各孔的培养上清。其表达是导致Graves病发生的重要因素之一，检测1．2．3杂交瘤细胞株的克隆和筛选进行间接ELISA法筛其血清水平对于判断Graves病的严重程度和复发，选分泌抗ICAM一1mAb的杂交瘤细胞株。以ICAM-1为包被自身免疫紊乱的情况，以及治疗中是否该停药具有抗原，以免疫小鼠血清为阳性对照，Sp2／0细胞的培养上清为重要的意义，因此，利用纯品ICAM一1免疫小鼠制备阴性对照，于波长405nm用酶标仪测定各孔的A值。采用有限稀释法对连续2次检测为阳性的细胞株进行克隆化，直

7、至抗ICAM1的mAb，为进一步提供诊治Graves病的新所有克隆化的细胞全部为阳性，挑选生长良好且阳性较强的技术奠定了基础。细胞孔，将细胞接种于24孔板扩大培养，部分冻存备用。1．2．4杂交瘤细胞分泌mAb的稳定性将分泌mAb的杂交1材料和方法瘤细胞连续培养2个月以上。用间接ELISA法检测培养上清1．1材料重组人ICAM一1蛋白纯品购自美国R&D公司。mAb的效价。将冻存6个月的杂交瘤细胞株复苏后，再检测6～8N龄雌性清洁级BALB／c小鼠购自北京中国医学科学院其分泌的mAb的效价有无明显变化。实验动物中心。Sp2／0小鼠骨髓瘤细胞为本

8、研究室保存。Ig1．2．5腹水mAb的制备及纯化选1O周龄BALB／e小鼠20亚类检测试剂盒、聚乙二醇、弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐只，在接种杂交瘤细胞前1—2周，腹腔注射0．5m