七种水蛭组织细胞可溶性蛋白SDS-PAGE电泳分析.doc

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1、七种水蛭组织细胞可溶性蛋白SDS-PAGE电泳分析　　摘要：采用垂直平板十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法对我国７种常见水蛭的组织细胞可溶性蛋白成分进行电泳图谱特性分析。结果表明，７种水蛭组织细胞中可溶性蛋白的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ图谱中多数条带相同，但也存在差异。其中日本医蛭蛋白条带最多，达２８个，并且吸血蛭类的蛋白条数要明显大于非吸血蛭类，而３种不同地理分布的菲牛蛭间表达蛋白图谱无明显差异。该研究为在分子水平分析我国水蛭不同种类、同种不同地理分布及不同食性间的差异积累了新的生物学数据，对其分类和药材鉴别提供了参考依据。　　关键词：水蛭；可溶性蛋白；十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳　　中图

2、分类号：Ｑ５０３文献标识码：Ａ文章编号：0439－８11416－3423-03　　　　AnalysisofSolubleProteinsinHistiocyteofSevenLeechSpeciesbySDS-PAGE　　　　ＷＡＮＧＢｏ１，ＺＨＡＮＧＢｉｎ２，ＧＯＮＧＹｕａｎ３，ＹＵＸｉａｎｇ４，Ｌ?�BＪｕｎ－ｙｉ５　　　　　　Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＴｈｅｈｉｓｔｉｏｃｙｔｅｓｏｌｕｂｌｅｐｒｏｔｅｉｎｓｏｆｓｅｖｅｎｌｅｅｃｈｅｓｉｎＣｈｉｎａｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄｔｈｒｏｕｇｈＳＤＳ－ＰＡＧＥ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｓｅｖｅｎｌｅｅｃｈｓｐｅｃｉｅｓｓｈａｒｅ

3、ｄｍｏｓｔｏｆｔｈｅｓｏｌｕｂｌｅｐｒｏｔｅｉｎｓｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｏｆｈｉｓｔｉｏｃｙｔｅ；ｗｈｉｌｅａｆｅｗｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓｅｘｉｓｔｅｄ．ＨｉｒｕｄｏｎｉｐｐｏｎｉａWhitmanｈａｄｔｈｅｌａｒｇｅｓｔｎｕｍｂｅｒｏｆｐｒｏｔｅｉｎｂａｎｄｓof２８．Ｔｈｅｒｅｗｅｒｅｍｏｒｅｐｒｏｔｅｉｎｂａｎｄｓｏｆｂｌｏｏｄ－ｓｕｃｋｉｎｇｌｅｅｃｈｅｓｔｈａｎｔｈａｔｏｆｎｏｎ－ｂｌｏｏｄｓｕｃｋｉｎｇｌｅｅｃｈｅｓ．ＮｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄａｍｏｎｇｔｈｅｈｉｓｔｉｏｃｙｔｅｓｏｌｕｂｌｅｐｒｏｔｅｉｎｓｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｏｆＨ．ｍ

4、ａｎｉｌｌｅｎｓｉｓLessonｆｒｏｍｔｈｒｅｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔａｒｅａｓ．ＩｔｗａｓｐｒｏｖｅｄｔｈａｔＳＤＳ－ＰＡＧＥｃｏｕｌｄｂｅｕｓｅｄｆｏｒｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｌｅｅｃｈｅｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｖａｒｉｅｔｉｅｓ，ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎａｎｄｆｏｏｄｈａｂｉｔａｔｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｌｅｖｅｌ，ａｎｄitａｃｃｕｍｕｌａｔｅｄｄａｔａｂａｓｅｏｆｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｐｒｏｐｅｒｔｙ．　　Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｌｅｅｃｈ；ｓｏｌｕｂｌｅ－ｐｒｏｔｅｉｎ；ＳＤＳ－ＰＡＧＥ　　　　水蛭具有医用价值，其药效在《神农

5、本草经》中就有记载，它有破血、逐瘀、通经的功效，主要用于治疗瘤症、痞块、血瘀、闭经和跌打损伤［１］。水蛭种类繁多，全世界记载命名的有６８０多种，其中我国有记录的蛭类就达１００余种［２，３］。我国有医用价值的蛭类主要集中在医蛭形亚目的医蛭科、黄蛭科和山蛭科［１，４］。我国最新药典规定的药用水蛭有３种：蚂蟥、柳叶蚂蟥、水蛭，它们分属于黄蛭科和医蛭科［５］。在国内水蛭药材市场，一般通过形态学特征加以鉴定，易造成人为的误判，因此有必要通过理化和分子手段来进行水蛭药材的辅助鉴别。目前，有通过薄层层析和蛋白电泳方法来对历版药典收录的３种水蛭炮制品进行鉴别的报道［６－８］，而针对水蛭活体的鉴别研究仅有关

6、于日本医蛭和天目山蛭４种同工酶蛋白电泳比较研究的报道［９］。试验采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对我国７种不同食性和地理分布的水蛭活体组织细胞可溶性蛋白表达特征及差异进行了分析，为水蛭资源分析、种类鉴定和种类间遗传多样性分析提供一定参考。　　１材料与方法　　１．１试验材料　　宽体金线蛭和光润金线蛭产于江苏省宿迁市，尖细金线蛭产于山东省鱼台县，日本医蛭产于湖北省公安县，３种野生菲牛蛭分别产于广东省清远市、广西壮族自治区钦州市和海南省琼中县。　　１．２试验试剂　　丙烯酰胺、Ｎ，Ｎ－亚甲基双丙烯酰胺、ＳＤＳ和β－巯基乙醇等购自Ｓｉｇｍａ公司；过硫酸铵、N，N，N′，N′-四甲基乙二胺、

7、Ｔｒｉｓ碱、溴酚蓝、冰醋酸和考马斯亮蓝Ｒ－２５０等购自广州威佳生物科技有限公司；ＲＩＰＡ裂解液、ＢＣＡ蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物科技有限公司。　　１．３蛋白样品制备及纯化　　①活体水蛭低温处死后将其肠道翻出，用去离子水洗净内容物，把组织剪切成细小的碎末，用研钵在液氮条件下将样品研磨成细粉末状［９］；②取适量ＲＩＰＡ裂解液，在使用前数分钟内加入苯甲基磺酰氟，使其最终浓度为１ｍｍｏｌ／Ｌ；按每２０ｍｇ组织加入１５０～２