实验二、 利用sds-page分析融合蛋白的可溶性

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1、现代微生物学实验技术谢响明教授北京林业大学生物科学与技术学院利用SDS-PAGE分析融合蛋白的可溶性实验目的1.了解利用基因工程技术在大肠杆菌中表达外源蛋白的原理；2.掌握SDS-PAGE的原理、实验操作过程及重要性。实验原理基因的基本结构基因转录区启动子ATG终止子TGAORF：OpeningReadingFrameRNA起始点核糖体结合位点实验原理影响基因表达的因素：启动子：控制基因表达的第一步，是高表达的关键；结构基因：密码子稀有性；表达载体的拷贝数：商业化，pET系列、pGEX系列等。实验原理目的基因：受噬菌体T7强转录、翻译及终止信号控制；Lac操纵子；T7RNA聚合酶启动；IP

2、TG诱导；有His-tagg标签；大肠杆菌BL21切接增转筛表达实验材料1.菌株：pET28a-svixyn/BL21(DE3)2.培养基及试剂(1).培养基：LB液体培养基(2).电泳溶液A.凝胶贮存液：丙烯酰胺29g；甲叉丙烯酰胺1g，加水至100ml，置于棕色瓶中，4℃存放。B.8×浓缩胶缓冲液：1mol/LTris-HCl,pH6.8,4℃存放。C.4×分离胶缓冲液：1.5mol/LTis-HCl,pH8.8,4℃存放。D.Tris-甘氨酸电泳缓冲液：Tris3.03g,甘氨酸14.4g，SDS1.0g，pH8.3，4℃存放。E.上样缓冲液：50mmol/LTris-HCl(pH6

3、.8),100mmol/L巯基乙醇，2%(m/v)SDS,0.1%溴酚蓝，10%(v/v)甘油。F.10%SDSG.10%过硫酸铵H.TEMED(N,N,N´,N´-四甲基乙二胺)3.仪器设备：垂直板电泳槽，电泳仪、超声破碎仪、移液器、摇床等实验步骤1.菌种的活化及酶的诱导表达菌种活化：挑pET28a-svixyn/BL21(DE3)单菌落于、5mlLB+Km液体培养基37℃培养18h。酶的诱导表达：1%的接种量转接于20mlLB+Km液体培养基于37℃培养至OD600=0.5-0.6，加入IPTG至终浓度1.0mmol/L，于30℃摇床振荡培养2-6h，以空载体为对照。2.融合蛋白的可溶

4、性分析：(1).12000rpm离心收集菌体，溶于无菌水中；(2).超声破碎菌体：功率200W，4sec，破碎90次，至菌液澄清；(3).12000rpm离心5min收集上清；(4).将沉淀悬于无菌水中；(5).分别取上清、沉淀做样品处理及SDS-PAGE分析。3.样品处理：向样品中加入等体积的SDS凝胶上样缓冲液，煮沸5min，冷却后上样或-20℃保存。4.电泳制胶点样电泳染(脱)色表分离胶与浓缩胶的配制12%分离胶5%浓缩胶水40%凝胶储液(ml)分离胶缓冲液(ml)浓缩胶缓冲液(ml)10%SDS(ml)10%过硫酸铵(ml)TEMED(ml)总体积(ml)6.39444.553.8

5、—0.150.150.006153.640.625—0.630.050.050.0055注意：灌胶前加过硫酸铵和TEMED制胶：事先装好电泳板，配分离胶后立即用注射器灌胶，加少量水覆盖胶平面，聚合30min；倒掉或用吸水纸吸干水后，灌浓缩胶，插上梳子，聚合30min。点样：小心将梳子拔掉；加入电泳缓冲液没过高低玻璃板中的低板，加样20-40μl。注：一定要记住点样顺序电泳：稳压，浓缩胶电压60V，电流约为10-15mA；分离胶电压150V，电流约25-30mA，电泳3-4小时，至指示剂溴酚蓝到达底部。染(脱)色：考马斯亮蓝R-250染色约1h，后沸水脱色约15min，知道蓝色退去。实验结果

6、1.电泳结果图片2.说明你认为整个实验过程中有哪些注意事项