SDS-PAGE 蛋白电泳分析

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1、实验二SDS－PAGE蛋白电泳分析一、目的掌握SDS-PAGE电泳原理与方法二、电泳原理聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺(简称Acr)和交联剂N，N’—亚甲基双丙烯酰胺（简称Bis）在催化剂作用下，聚合交联而成的具有网状立体结构的凝胶，并以此为支持物进行电泳。聚丙烯酰胺凝胶电泳可根据不同蛋白质分子所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率将蛋白质分离成若干条带，如果分离纯化的样品中只含有同一种蛋白质，蛋白质样品电泳后，就应只分离出一条区带。SDS是一种阴离子表面活性剂能打断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷

2、的量远远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。因此，各种蛋白质-SDS复合物在电泳时的迁移率，不再受原有电荷和分子形状的影响，而只是棒长的函数。这种电泳方法称为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（简称SDS—PAGE）。由于SDS-PAGE可设法将电泳时蛋白质电荷差异这一因素除去或减小到可以略而不计的程度，因此常用来鉴定蛋白质分离样品的纯化程度，如果被鉴定的蛋白质样品很纯，只含有一种具三级结构的蛋白质或含有相同分子量亚基的具四级结构的蛋白质，那么SDS—PAGE后，就只出现一条蛋白质区带。三、试剂配制1．30%丙烯酰胺：将29g丙烯酰胺和

3、1gN，N’-亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为60ml的水中。加热至37℃溶解之，补加水至终体积为100ml。用过滤器（0.45μm孔径）过滤除菌，查证该溶液的pH值应不大于7.0，置棕色瓶中保存于室温(丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可以通过皮肤吸收，其作用具累积性。称量丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺时应戴手套和面具。可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能会含有少量未聚合材料)。2．1MTris-Cl:称取12.191gTris碱溶于80ml蒸馏水中，用浓HCl调到所需pH值，定容至100ml。1.5M：Tris碱18.15g去离子水80ml浓盐酸调P

4、H值8.8加去离子水定容至100ml3．1MDTT：称取3.09gDTT，加入到50ml塑料离心管内，加20ml的0.01MNaOAc（pH5.2)，溶解后使用0.22mm滤器过滤除菌适量分成小份后，-20℃保存。4．10%SDS:20gSDS溶于200ml纯水中。5．10%过硫酸铵：1g过硫酸铵溶于10ml纯水中，现用现配。6．2×SDS上样缓冲液：1.0mol/LTris-Cl(pH6.8)10ml，10%SDS40ml，50%甘油40ml，0.2g溴芬蓝，定容至100ml。7．10×Tris-甘氨酸电泳缓冲液，3gTris碱和18.8g甘氨酸，

5、加入10ml10%SDS，用去离子水补至100ml，配制成10×Tris-甘氨酸电泳缓冲液；取50ml10×缓冲液，稀释至500ml，配制成工作浓度1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液。8．考马斯亮蓝R250染色液：1gR250溶于250ml异丙醇、100ml冰乙酸和650ml去离子水的混合液中，过滤去除颗粒状物。9．脱色液：乙醇/水/冰乙酸分别为50ml,850ml和100ml。四、实验方法1．10%分离胶的配制7ml(小板为5ml)：按附录添加适量的试剂，立即倒胶，加水封胶待凝固。2．吸干封液的水，倒浓缩胶。3.5%浓缩胶的配制3ml：按附录添加适量的

6、试剂，立即倒胶，插入梳子待凝固。3．取下梳子，用蒸馏水冲洗梳孔，洗净其中的残余胶块，用滤纸吸干。4．将制成的胶放入电泳槽内，倒入1×甘氨酸电泳缓冲液，观察不渗漏即可。5．取10μl样品，加入等体积的2×SDS上样缓冲液，样品与蛋白质Maker100℃保温5min。6．分别取10μl上样，110V恒压电泳2～3小时。7．将胶剥下至一平皿中，加入考马斯亮蓝染色1～2小时，回收染色液后，倒入脱色液脱色过夜，其间换脱色液1～2次。五、实验结果观察电泳结果，分析蛋白大小，结合实验一，通过蛋白条带的变化分析细胞破碎效果六、见附录1：分离胶和浓缩胶配方表