SDS-PAGE及tricine蛋白电泳

《SDS-PAGE及tricine蛋白电泳》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、1.1蛋白质电泳SDS-PAGE1.1.1溶液配制Tris缓冲液（1.5M，pH8.8）90.86gTris溶于400ml水中，加HCl调pH至8.8，定溶至500ml。Tris缓冲液（1.0M，pH6.8）60.57gTris溶于400ml水中，加HCl调pH至6.8，定溶至500ml。30%丙烯酰胺29g丙烯酰胺1gN,N’-亚甲双丙烯酰胺溶于60ml水（可用37℃水浴溶解），定溶至100ml，过滤后装入棕色瓶，放置4℃保存。10%SDS20gSDS溶于200ml水。5×Tris甘氨酸缓冲液15.5gTris（1×:25mM）94g甘氨酸（1×:250mM）5gSDS（1×:0.1%

2、）或者加50ml10%SDS溶液定容至1L，使用时稀释5倍。5×SDS-PAGELoadingBuffer1.25ml1MTris-HCl pH6.8（终浓度：250mM）0.5gSDS（终浓度：10%）25mg溴酚蓝（终浓度：0.5%）2.5ml甘油（终浓度：50%）350mg二硫苏糖醇DTT（终浓度约为500mM）加入去离子水溶解后定容至5ml，小份（500μl）分装，低温保存。5×SDS-PAGELoadingBuffer0.6ml1MTris-HCl pH6.8（终浓度：60mM）2ml10%SDS（终浓度：2%）1ml1%溴酚蓝（终浓度：0.1%）5ml50%甘油（终浓度：25

3、%）0.5ml巯基乙醇（终浓度约为14.4mM）加入去离子水溶解后定容至10ml，小份（500μl）分装，低温保存。2×SDS-PAGELoadingBuffer1.25ml1MTris-HCl pH6.80.2gSDS0.25ml巯基乙醇2.5ml甘油0.05ml2%溴酚兰（溶于乙醇）1.9mlH2O定容至10ml，小份（500μl）分装，低温保存。5×SDS-PAGELoadingBuffer（非还原）0.4ml1.5MTris-HCl pH8.82ml10%SDS10mg溴酚蓝2.5ml甘油5.1mlH2O定容至10ml，小份（500μl）分装，低温保存。染色液（100ml）45m

4、l甲醇or乙醇10ml乙酸0.25gCoomassieBrilliantBlueR-250定容至100ml。洗脱液30%甲醇or乙醇10%乙酸1.1TricineSDS-PAGE1.1.1溶液配制正极缓冲液anodebuffer（1×）0.2MTris(pH8.9)：12.114g加H20定容至500ml,4℃保存。负极缓冲液cathodebuffer（1×）0.1MTris+0.1MTricine+0.1%SDS不用调pH：6.057gTris+8.96gTricine+0.5gSDS加H20定容至500ml,4℃保存。凝胶缓冲液gelbuffer（G-B,3×）36.342gTris

5、+0.3gSDS加H20定容至100ml,HCl调pH=8.45，过滤4℃保存。AB-3储存液（49.5%T,3%Cmixture）24g丙烯酰胺+0.75g甲叉双丙烯酰胺，加H20定容至50ml，过滤4℃保存。AB-6储存液（49.5%T,6%Cmixture）23.25g丙烯酰胺+1.5g甲叉双丙烯酰胺加H20定容至50ml，过滤4℃保存。1.1.2制胶配方10%分离胶（8ml）1.6mlAB-62.67ml3×gelbuffer1ml50%甘油2.73ml水0.04ml10%APS0.004mlTEMED4%积层胶（4ml）0.33mlAB-31ml3×gelbuffer2.67m

6、l水0.03ml10%APS0.0033mlTEMED1.1.3电泳操作制胶同SDS-PAGE。电泳：1.在电泳槽底部加入正极缓冲液，将制好的胶连同其装置放入电泳槽内，在两块胶之间注入负极缓冲液。1.用30V的电压预电泳10分钟，然后上样。2.开始电泳。电压30V。当蓝色染料从积层胶进入分离胶后，电压加到90V。其他步骤同SDS-PAGE。1.1蛋白质沉淀（proteinprecipitation）1.1.1丙酮沉淀蛋白质1.纯丙酮放置在-20℃预冷5h。2.1体积的蛋白样品加入4体积的冰冻丙酮，混合后放置于-20℃20min（蛋白浓度低可延长冷冻时间）。3.4℃，15000g离心15m

7、in，小心移出上清，保留沉淀。将离心管倒置晾干残留丙酮。4.取微量水重溶沉淀。（若使用乙醇沉淀蛋白，1体积的蛋白样品加入9体积的冰冻乙醇。步骤3后清洗沉淀1次。）1.1.2硫酸铵沉淀蛋白质1.1体积的蛋白样品加入1体积的饱和(NH4)2SO4，终饱和度为50%（约2M）或70%（约3.2M）。混合后放置于4℃3h（蛋白浓度低可延长冷冻时间）。2.4℃，15000g离心15min，小心移出上清，保留沉淀。将离心管倒置晾干残留液。3.取