SDS-PAGE电泳

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1、实验六SDS-PAGE电泳武汉生物医学研究院2013年4月3日实验目的学习SDS-PAGE电泳的基本原理掌握垂直板电泳的操作方法运用SDS-PAGE测定蛋白质分子量及染色鉴定SDS-PAGE电泳的基本原理电泳:带电颗粒在电场的作用下，向着与其电性相反的电极移动，称为电泳。正极负极带负电粒子带正电粒子SDS-PAGE电泳的基本原理聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳是以聚丙烯酰胺凝胶为载体的一种区带电泳。该凝胶由丙烯酰胺（Acr）和交联剂N，N—甲叉双丙烯聚酰胺（Bis）聚合而成。利用电泳和分子筛的双重作用分离物质。在聚丙烯酰胺凝胶电泳中，蛋白质的迁移率取决于它所带的净电荷的多少、分子的大小和

2、形状等因素。如果用过量的还原剂（如巯基乙醇或二硫苏糖醇等）和十二烷基硫酸钠（缩写SDS）加热处理蛋白质样品，蛋白质分子中的二硫键将被还原，蛋白质-SDS复合物具有相同的电荷密度，并引起蛋白质构象改变，使蛋白质在凝胶中的迁移率不再受原带的电荷和形状的影响，而取决于相对分子质量的大小，电泳时纯粹靠凝胶的分子筛效应进行分离。SDS-PAGE电泳的基本原理Acr和Bis单独存在或混合在一起时是稳定的，但在具有自由基团体系时就能聚合。引发自由基团的方法有化学法和光化学法两种。化学法的引发剂是过硫酸胺（Ap），催化剂是四甲基乙二胺（TEMED）；光化学法是以光敏感物核黄素来代替过硫酸铵，在紫外光照

3、射下引发自由基团。采用不同浓度的Acr、Bis、Ap、TEMED使之聚合，产生不同孔径的凝胶。因此可按分离物质的大小，形状来选择凝胶浓度。SDS-PAGE电泳的基本原理SDS-PAGE电泳的基本原理SDS-PAGE电泳的基本原理SDS-PAGE电泳的基本原理1.材料：前期实验中提取的蛋白2．试剂：(1)30%丙烯酰胺(Acr)：称Acr30g，甲叉双丙烯酰胺(Bis)0.8g，加蒸馏水至100ml，过滤后置棕色瓶中，4℃贮存可用1-2月。(2)10%SDS(十二烷基磺酸钠)(3)1.5mol/lpH8.8Tris-HCl缓冲液：称取Tris18.2g，加入50ml水，用1mol/l盐酸

4、调pH8.8，最后用蒸馏水定容至100ml。(4)1.0mol/lpH6.8Tris-HCl缓冲液：称取Tris12.1g，加入50ml水，用1mol/l盐酸调pH6.8，最后用蒸馏水定容至100ml。(5)0.05mol/lpH8.0Tris-HCl缓冲液：称取Tris0.6g，加入50ml水，用1mol/l盐酸调pH8.0，蒸馏水定容至100ml。SDS-PAGE电泳的基本原理(6)10%过硫酸铵(AP)(7)TEMED(四甲基乙二胺)(8)上样缓冲液：SDS(100mg)+巯基乙醇(0.1ml)+溴酚蓝(2mg)+甘油(2g)+0.05mol/LpH8.0Tris-HCl(2ml

5、)，最后定容至10ml。(9)固定液：取50%甲醇454ml，冰乙酸46ml混匀。(10)染色液：称取考马斯亮蓝R2500.125g，加上述固定液250ml，过滤后备用。(11)脱色液：冰乙酸75ml，甲醇50ml，加蒸馏水定容至1000ml。(12)电泳缓冲液:称Tris6.0g，甘氨酸28.8g，加入SDS1g，加蒸馏水使其溶解后定容至1000ml。SDS-PAGE电泳的基本原理垂直板电泳装置直流稳压电源移液管滤纸微量注射器大培养皿3.实验设备将红色玻璃夹子底座朝下、卡口打开呈直角状，放入厚薄两片玻璃，薄玻璃朝向自己。注意厚玻璃箭头向上，旁边两条小玻璃条与薄玻璃接触，使之形成一个间

6、隙。在平整的桌面上放下玻璃与夹子，使玻璃和夹子的底面完全对齐，向外扳动塑料卡口，关紧夹子。SDS-PAGE电泳的操作方法1．装配制胶用的玻璃板将做好的玻璃夹放在制胶架上，注意薄玻璃朝向自己，厚玻璃上的箭头向上。按弹簧夹，将玻璃夹卡入制胶架。在玻璃的间隙内灌胶，放上梳子，待胶凝固。SDS-PAGE电泳的操作方法2.制分离胶和浓缩胶(1)制分离胶：按所需的浓度配制15％分离胶。TEMED最后加，快速混匀后用移液枪灌胶，由固定位置灌入，注意不能有气泡；灌完分离胶后在胶面上小心加1毫升水封（注意不要冲坏胶面），等胶自然凝聚（这时候在胶面与水封之间可以看见清晰的界限）。30%Acr-BisTri

7、s-HClpH8.810%SDSH2O10%APTEMED2.5ml1.3ml50l1.1ml50l2lSDS-PAGE电泳的操作方法加入分离胶溶液pH8.8封水或饱和正丁醇溶液出现明显界面时，分离胶凝聚完成（３０min~１h）倒出水或正丁醇，并用滤纸吸干制备分离胶封水的目的是使分离胶上表面平直，并排除气泡。凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。(2)制浓缩胶：按所需的浓度配制5％浓缩胶。30%Acr-BisTris-HClpH6