SDS-PAGE电泳

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1、SDS-PAGE测量蛋白分子量所需试剂及仪器：试剂：丙烯酰胺，双丙烯酰胺，Tris-base，TEMED，SDS，过硫酸铵，甘油，溴酚兰，甘氨酸，DTT，考马斯亮蓝R-250，甲醇，冰醋酸，蛋白Marker5只（50ul装），小牛血清白蛋白10mg。仪器设备：电泳仪、槽、板5套；10ml小烧杯10只，微量移液器5把，普通移液器5套，足量滤纸，0.45μm滤器。母液：1、2MTris-HCL(pH8.8)100ml：24.2gTris-base，50ml蒸馏水，加入浓盐酸调pH8.8，最后定容至100ml。高压灭菌处理。2、1MTris-HCL(pH6.8)100

2、ml：12.1gTris-base，50ml蒸馏水，加入浓盐酸调pH6.8，最后定容至100ml。高压灭菌处理。3、10%SDS100ml：10gSDS，加入70ml蒸馏水在60℃搅拌溶解，待泡沫消失后，定容至100ml。4、50%（w/v）甘油 100ml：50ml甘油，50ml蒸馏水，混匀即可。5、1%（w/v）溴酚兰10ml：100mg溴酚兰，蒸馏水定容至10ml。6、0.01mol/L乙酸钠溶液100ml：0.139g乙酸钠溶于100ml蒸馏水中，调pH至5.2。7、1MDTT 20ml：20ml0.01mol/L乙酸钠溶液溶解3.09gDTT，过滤除菌

3、后分装成1ml/份，-20℃保存。工作液：1、30%聚丙酰胺母液（A液）实际需要250ml100ml：                   丙烯酰胺29g，双丙烯酰胺1g，去离子水在37℃溶解，定容到100ml。0.45μm滤器过滤除菌，棕色瓶保存。pH≤7.0。2、4×分离胶缓冲液（B液）10100ml：                  75ml2MTris-HCL(pH8.8)                          4ml10%SDS                          21ml蒸馏水                       

4、   4℃存放。3、4×浓缩胶缓冲液（C液）100ml：                   50ml1MTris-HCL(pH6.8)                          4ml10%SDS                          46ml蒸馏水                          4℃存放。4、10%过硫酸铵（D液）5ml：                 0.5g过硫酸铵，5ml蒸馏水，0.1ml分装。5、TEMED（E液）5、1×Tris-甘氨酸缓冲液1L：Tris-base3g                   

5、       甘氨酸14.4g                          SDS1g                          蒸馏水定容到1L，pH8.3左右。6、5×上样缓冲液 10ml：                 0.5ml1MTris-HCL（pH6.8）                       1ml1MDTT                       2ml10%SDS                       1ml1%溴酚兰                       5ml50%甘油                

6、       0.5ml蒸馏水7、考马斯亮蓝染色液 1L：                   考马斯亮蓝R-2501.0g                       甲醇450ml                       冰醋酸100ml                       蒸馏水450ml8、考马斯亮蓝脱色液 1L：                   甲醇100ml                       冰醋酸100ml                       蒸馏水800ml步骤：一、组装模具：10用海绵蘸取少量清洁剂，擦洗干净两

7、块玻璃板，自来水冲洗3—5遍然后，再用无水乙醇冲洗2遍，晾干待用。将已清洗干净的两块玻璃板用封条封严。组装在电泳架上，浅玻璃板朝外（靠近操作者一侧），然后固定结实。（注意：清洗玻璃板时动作要轻柔，切勿划破玻璃面；清洗干净之后，不要用手碰玻璃面。）二、制胶：1、  配10%分离胶10ml：吸取A液3.3ml，B液2.5ml，蒸馏水4.2ml，D液100μl，在小烧杯中摇匀，再加入E液10μl，立即混匀并用10ml注射器吸取大约8ml混合溶液，沿着玻璃板之间缝隙左上处，缓慢灌胶，一直到距前玻璃板上沿1.5cm处为止。（注意：A当凝胶完全浸没玻璃板底的时候，留意观察是

8、否漏胶。若漏胶，则立即停