SDS-PAGE电泳检测

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1、周次第周，第次课编写时间2012章节名称实验一、蔗糖酶的提取及其性质的研究——分离产物的SDS-PAGE电泳检测授课方式课堂讲授（），实践课（√）教学时数6时间分配授课要点教学重点和难点重点：1.SDS—聚丙烯酰胺电泳法的原理。2.测定蛋白质的分子量的方法难点：SDS-PAGE的操作方法教学内容一、实验目的1.掌握SDS—聚丙烯酰胺电泳法的原理。2.学会用此种方法测定蛋白质的分子量二、实验原理SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)是对蛋白质进行量化，比较及特性鉴定的一种经济、快速、而且可重复的方法。

2、该法主要依据蛋白质的分子量对其进行分离。SDS与蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折叠结构，并使其稳定地存在于一个广泛均一的溶液中。SDS—蛋白质复合物的长度与其分子量成正比。由于在样品介质和聚丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，而电荷因素可以被忽略。SDS—PAGE因易于操作和广泛的用途，使它成为许多研究领域中一种重要的分析技术。SDS是十二烷基硫酸钠（sodiumdodecylsulfate）的简称，它是一种阴离子表面活性剂，加入到电泳系统中能使蛋白质的

3、氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上（在一定条件下，大多数蛋白质与SDS的结合比为1.4gSDS/1g蛋白质），使各种蛋白质—SDS复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。这样就使电泳迁移率只取决于分子大小这一因素，于是根据标准蛋白质分子量的对数和迁移率所作的标准曲线，可求得未知物的分子量。三、实验仪器及试剂实验仪器微型凝胶电泳装置；电源（电压200V，电流500mA）；100℃沸水浴；Eppendorf管；微量注射器（50μl或100

4、μl）；干胶器、真空泵或水泵；带盖的玻璃或塑料小容器；摇床等。试剂⑴2mol/lTris-HCl(pH8.8):取24.2gTris,加50ml蒸馏水，缓慢的加浓盐酸至pH8.8（约加4ml）；让溶液冷却至室温，pH将会升高，加蒸馏水至100ml。授课要点教学内容⑵1mol/lTris-HCl(pH8.8):取12.1gTris,加50ml蒸馏水，缓慢的加浓盐酸至pH6.8（约加8ml）；让溶液冷却至室温，pH将会升高，加蒸馏水至100ml。⑶10%(w/v)SDS:取10g的SDS，加蒸馏水至100ml。⑷

5、50%(v/v)甘油:取50ml100%甘油，加入50ml蒸馏水。⑸1%(w/v)溴酚蓝:取100mg溴酚蓝，加蒸馏水至10ml，搅拌,直到完全溶解，过滤除去聚合的染料。⑹A液--丙烯酰胺储备液（配制含30%(w/v)丙烯酰胺和0.8%(w/v)甲叉双丙烯酰胺的溶液100ml）在通风柜中操作，取29.2g丙烯酰胺，0.8g甲叉双丙烯酰胺，加蒸馏水至100ml，缓慢搅拌直至丙烯酰胺粉末完全溶解，用石蜡膜封口，可在4℃存放数月。⑺B液--4×分离胶缓冲液：取75ml2mol/lTris-HCl(pH8.8)，加入

6、4ml10%SDS,加21ml蒸馏水，混匀，可在4℃存放数月。⑻C液--4×浓缩胶缓冲液:取50ml1mol/lTris-HCl(pH6.8)，加入4ml10%SDS,加46ml蒸馏水，混匀，可在4℃存放数月。⑼10%过硫酸铵：取0.5g过硫酸铵，加入5ml蒸馏水，可保存在密封的管内，于4℃存放数月。⑽电泳缓冲液：取3gTris，14.4g甘氨酸，1gSDS，加蒸馏水至1l,pH约为8.3,也可配制成10×的储备液，在室温下长期保存。⑾5×样品缓冲液：取0.6ml1mol/lTris-HCl(pH6.8)，加

7、入2ml10%SDS,5ml50%的甘油，0.5ml2-巯基乙醇，1ml1%溴酚蓝，0.9ml的蒸馏水混匀，可在4℃保存数周，或在-20℃保存数月。⑿考马斯亮蓝染液：1.0g考马斯亮蓝R-250，加入450ml甲醇，450ml蒸馏水及100ml冰醋酸即成。⒀考马斯亮蓝脱色液：将100ml甲醇，100ml冰醋酸，800ml蒸馏水混匀备用。四、操作步骤1.灌制分离胶⑴组装凝胶模具:可按照使用说明书装配好灌胶用的模具。对于Bio-Rad的微型凝胶电泳系统，在上紧螺丝之前，必须确保凝胶玻璃板和隔片的底部与一个平滑的表

8、面紧密接触，有细微的不匹配就会导致凝胶的渗漏。⑵将A液、B液及蒸馏水在一个小烧瓶或试管中混合，丙烯酰胺(A液中)是神经毒素，操作时必须戴手套。加入过硫酸铵和TEMED后，轻轻搅拌使其混匀(过量气泡的产生会干扰聚合)。凝胶很快会聚合，操作要迅速。小心将凝胶溶液用吸管沿隔片缓慢加入模具内，这样可以避免在凝胶内产生气泡。⑶当加入适量的分离胶溶液时(对于小凝胶，凝胶液加至约距前玻璃板顶端1.5cm或距梳子齿