sds-page电泳过程解析

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1、Sds-page电泳培训资料培训人：刘小强1.实验目的学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理。掌握垂直板电泳的操作方法。运用SDS-PAGE测定蛋白质分子量及染色鉴定2.实验原理带电质点在电场中向带有异相电荷的电极移动，这种现象称为电泳。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠），SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了

2、原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。3.实验试剂水：当天纯化水A液：B液：C液：1%SDS(要配置成10%的母液)D液：E液：10%AP:F液：TEMED染色液：考马斯亮蓝（先用50ML的乙酸溶解再加甲醇和水）脱色液：50ML的乙酸+200ML的甲醇+250ML水4.器材JUNYI-1600电源BOI-RAD电泳槽5.技术参数250V电压浓缩胶使用15MA电流（每块胶），分离胶使用30MA电流电泳时间：在

3、溴酚蓝跑到浓缩胶和分离胶交界的地方调高电流继续电泳，等溴酚蓝跑的玻璃板底部停止。6.制胶将玻璃板用蒸馏水洗净晾干把玻璃板在灌胶支架上固定好.※固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹坏玻璃板.按比例配好分离胶,用移液管快速加入※凝胶配制过程要迅速,催化剂TEMED要在注胶前再加入,否则凝结无法注胶.注胶过程最好一次性完成,避免产生气泡.※水封的目的是为了使分离胶上延平直，并排除气泡※凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面.倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干,按比例配好浓缩胶,连续平稳加入浓缩胶至离边缘5mm处,迅速插入样梳,静置40分钟.※样梳需一次平稳插入,梳口处

4、不得有气泡,梳底需水平.7.样品处理把样品稀释到合适浓度，按样品和样品缓冲液3:1的比例加入MARKER10UL水+1ULMARKER+5UL还原BAFFUR沸水煮5分钟，离心8000RPM/5分钟，然后上样8.凝胶板剥离与染色：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板做好标记后放在塑料盒内，加入染色液，染色过夜。脱色：染色后的凝胶，弃掉染色液，加入脱色液在摇床上再脱色，直到蛋白质区带清晰。※剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要充分.实验结果分析：凝胶成像系统SDS-PAGE电泳过程中影响结果的因素：1.配胶缓冲液系统对电泳的影响？在SDS－PAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使

5、用的是Tris－HCL缓冲系统，浓缩胶是pH6.7，分离胶pH8.9；而电泳缓冲液使用的Tris－甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中，其pH环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而CL离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压剃度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。当样品进入分离胶后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。所以，pH

6、对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素。2.样品如何处理？根据样品分离目的不同，主要有三种处理方法：还原SDS处理、非还原SDS处理、带有烷基化作用的还原SDS处理。1）还原SDS处理：在上样buffer中加入SDS和DTT（或Beta巯基乙醇）后，蛋白质构象被解离，电荷被中和，形成SDS与蛋白相结合的分子，在电泳中，只根据分子量来分离。一般电泳均按这种方式处理，样品稀释适当浓度，加入上样Buffer，离心，沸水煮5min，再离心加样。2）带有烷基化作用的还原SDS处理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久

7、牢固的保护SH基团，得到较窄的谱带；另碘乙酸胺可捕集过量的DTT，而防止银染时的纹理现象。100ul样品缓冲液中10ul20％的碘乙酸胺，并在室温保温30min。3）非还原SDS处理：生理体液、血清、尿素等样品，一般只用1％SDS沸水中煮3min，未加还原剂，因而蛋白折叠未被破坏，不可作为测定分子量来使用。3.SDS-PAGE电泳凝胶中各主要成分的作用？聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关；制胶缓冲液：浓缩胶选择pH6.7，分离胶选择pH8.9，选择tris－HCL系统，TEME