SDS-PAGE蛋白电泳方法资料

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1、SDS-PAGE一.实验原理SDS是一种阴离子表面活性剂，在蛋白质溶液里加入SDS和巯基乙醇后，巯基乙醇能使蛋白质分子中的二硫键还原，SDS能使蛋白质的氢键、疏水键打开并结合到蛋白质分子上，形成蛋白质-SDS复合物。在一定条件下，SDS与大多数蛋白质的结合比例为1.4:1。由于十二烷基磺酸根带负电，使各种蛋白质的SDS-复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。SDS与蛋白质结合后，还引起了蛋白质构象的改变。蛋白质-SDS复合物的流体力

2、学和光学性质表明，它们在水溶液中的形状，近似于雪茄烟形的长椭圆棒，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样，约为1.8nm，而长轴则随蛋白质的Mr成正比的变化。基于上述原因，蛋白质-SDS复合物在凝胶电泳中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只与椭圆棒的长度有关，也就是蛋白质Mr的函数。二.试剂器材30%凝胶贮液(100mL)：称取试剂Acr29.2g和Bis0.8g置于100mL烧杯中，向烧杯中加入约60mL双蒸水，充分搅拌溶解后加双蒸水定容至100mL，置于棕色瓶内4℃贮存，每过1-2个

3、月应重新配制；注意：丙稀酰胺具有很强的神经毒性，并可通过皮肤吸收，其作用有积累性，配制时应戴手套和口罩等。分离胶缓冲液(1.5mol/LTris-HCl，pH8.8，100mL)：称取Tris18.2g溶于约80mL双蒸水，用6mol/L的HCl调整pH值至8.8，加双蒸水定容到100mL，4℃贮存；堆积胶缓冲液(0.5MTris-HCl，pH6.8，100mL)：称取Tris6.0g溶于约80mL双蒸水，用1mol/L的HCl调整pH值至6.8，加双蒸水定容到100mL，4℃贮存；电泳缓冲液(1L)

4、：称取试剂Tris3.03g和甘氨酸14.4g置于500mL烧杯中，向烧杯中加入约400mL双蒸水充分溶解，再加入10%SDS溶液1.0mL，以双蒸水定容至1L(自然pH值为8.3，无需再调)，4℃贮存，可重复使用5-6次；2×加样缓冲液(10mL)：取下列试剂置于10mL塑料离心管中0.5mol/LTris-HCl缓冲液(pH6.8)2.0mL10%SDS溶液4.0mL甘油2.0mL巯基乙醇2.0mL溴酚蓝0.02g，混匀后1mL分装，-70℃可贮存6个月；10%AP：称取(NH4)2S2O31.0

5、g，溶于10.0mL双蒸水中，分装成每份1mL，-20℃贮存；TEMED：分装成每份1mL，4℃避光贮存；水饱和正丁醇(100mL)：在玻璃瓶中加入50mL双蒸水和50mL正丁醇，振摇。上层相即水饱和正丁醇，室温下可长期保存。染色液(100mL)：称取考马斯亮蓝R-2500.25g，加入双蒸水40.0mL、甲醇50.0mL和乙酸10.0mL，搅拌溶解后滤纸过滤除去不溶颗粒；脱色液(1L)：分别取甲醇50mL和乙酸75mL，加双蒸水875mL稀释。其他器材：容量瓶(1L、100ml、10ml)、烧杯、离

6、心管(15ml、1.5ml)、移液器、移液器吸头、干燥器、涡旋振荡器和废液缸等。分离胶配方(100mL，4块胶)贮液分离胶中丙烯酰胺的终浓度(%)8.09.010.011.012.013.014.015.016.017.018.0凝胶贮液(mL)26.6730.0033.3336.6740.0043.3346.6750.0053.3356.6760.00分离胶缓冲液(mL)25双蒸水(mL)46.5343.2039.8736.5333.2029.8726.5323.2019.8716.5313.201

7、0%SDS(mL)1.010%AP(mL)0.75TEMED(mL)0.05(抽气后添加)堆积胶配方(40mL，4块胶)贮液堆积胶中丙烯酰胺的终浓度(%)3.04.05.0凝胶贮液(mL)4.005.366.66分离胶缓冲液(mL)10.0双蒸水(mL)25.3624.0022.7010%SDS(mL)0.410%AP(mL)0.2TEMED(mL)0.04(抽气后添加)一.操作步骤样品处理：在密封的螺盖微量离心管中，用2×加样缓冲液按1:1稀释蛋白质样品溶液，于100℃煮沸3-5min，分子质量标准

8、品也经上述处理。凝胶制备：将玻璃板用蒸馏水清洗干净，再用75%的酒精去脂，干燥后固定在灌胶支架上；配制12%的分离胶，加入TEMED前抽真空10min以除去丙烯酰胺溶液中的空气；加入TEMED后轻轻振荡混匀，迅速注入安装好的玻璃板的间隙中，给堆积胶留出约1cm的空间。在丙烯酰胺溶液上覆盖一层水饱和的正丁醇，以防止空气扩散到凝胶中抑制聚合作用，并保证凝胶表面水平；在室温条件下，凝胶应在30min-50min内聚合完成。凝胶聚合后凝胶和上层液相之间可见折射率