SDS-PAGE分离蛋白技术

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1、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白技术SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)是对蛋白质进行量化,比较及特性鉴定的一种经济,快捷,而且可重复的方法,该法主要依据蛋白质的分子量对其进行分离.【实验目的】掌握用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离不同蛋白质的方法.【实验原理】SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是蛋白分析中最经常使用的一种方法.它是将蛋白样品同离子型去垢剂十二烷基硫酸钠(SDS）及巯基乙醇一起加热，使蛋白变性，多肽链内部及肽键之间的二硫键被还原，肽键被打开，打开的肽键靠疏水作用与SDS结合而带负电荷，电泳时在电场作用下，肽链在凝胶中向正极迁移。不同

2、大小的肽链由于在迁移时受到的阻力不同，在迁移过程中逐渐分开，其相对迁移率与分子量的对数间成线形关系。【实验器材与试剂】一,仪器垂直板电泳槽及配套的玻璃板,梳子,电泳仪,干式恒温培养器,微波炉等.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白技术SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)是对蛋白质进行量化,比较及特性鉴定的一种经济,快捷,而且可重复的方法,该法主要依据蛋白质的分子量对其进行分离.【实验目的】掌握用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离不同蛋白质的方法.【实验原理】SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是蛋白分析中最经常使用的一种方法.它是将蛋白样品同离子型去垢剂十

3、二烷基硫酸钠(SDS）及巯基乙醇一起加热，使蛋白变性，多肽链内部及肽键之间的二硫键被还原，肽键被打开，打开的肽键靠疏水作用与SDS结合而带负电荷，电泳时在电场作用下，肽链在凝胶中向正极迁移。不同大小的肽链由于在迁移时受到的阻力不同，在迁移过程中逐渐分开，其相对迁移率与分子量的对数间成线形关系。【实验器材与试剂】一,仪器垂直板电泳槽及配套的玻璃板,梳子,电泳仪,干式恒温培养器,微波炉等.二,材料蛋白样品,蛋白标准品,EP管三，试剂1,1.5mol/LTris-HCLPh8.8（已加SDS）2,0.5mol/LTris-HCLpH6.8（已加SDS）3,10％SDS4,30

4、％丙烯酰胺（Acr/Bis）溶液：29.2g丙烯酰胺（Acr）+0.8g甲叉双丙烯酰胺(Bis)，用双蒸水定容至100ml，过滤备用，4℃下存放。5,10％过硫酸铵（AP）（-20℃存放）6,2×样品缓冲液0.5mol/LTris-HCLPh6.82ml甘油2ml20％SDS2ml0.1％溴酚蓝0.5mlβ-巯基乙醇2~1.0ml双蒸水2.5ml7,5×电泳缓冲液Tris7.5gGly36gSDS2.5g双蒸水溶解，定容至500ml，使用时稀释5倍。8，染色液：0.2考马斯亮蓝R250+84ml95％乙醇+20ml冰醋酸，定容至200ml，过滤备用9，脱色液：V（乙醇）

5、:V(冰醋酸)：V（水）=7.5:7.5:85【实验内容】一，聚丙烯酰胺凝胶的配制1，分离胶（10％）的配制：双蒸水4.0ml30％Acr/Bis3.3ml1.5mol/LTris-HCL2.5ml10％SDS0.1ml10％AP0.1ml取1ml上述混合液，加TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)10μL封底，余加TEMED4μL，混匀后灌入玻璃板间，以水封顶，注意使液面齐平，凝胶完全聚合需30~60min2，浓缩胶（4％）的配制：双蒸水1.4ml30％Acr/Bis0.33ml1mol/LTris-HCL0.25ml10％SDS0.02ml10％AP0.02

6、mlTEMED2μL将分离胶上的水倒去，加入上述混合液，立即将梳子插入玻璃板间，完全聚合15~30min。二，样品处理将样品加入等量的2×样品缓冲液，100℃加热3~5min，12000g离心1min，取上清作SDS-PAGE分析，同时将SDS低分子量蛋白标准品作平行处理。三，上样取10μL诱导与未诱导的处理后的样品加入样品池中，并加入20μL低分子量蛋白标准品作对照。四，电泳在电泳槽中加入1×电泳缓冲液，连接电源，负极在上，正极在下，电泳时，浓缩胶电压60V，分离胶电压100V，电泳至溴酚蓝行至电泳槽下端停止（约需3h）五，染色将胶从玻璃板中取出，考马斯亮蓝染色液染色

7、，室温4~6小时。六，脱色将胶从染色液中取出，放入脱色液中，多次脱色至蛋白带清晰。七，凝胶摄像和保存在图像处理系统下将脱色好的凝胶摄像，结果存于软盘中，凝胶保存于双蒸水中或7％乙酸溶液中。【注意事项】1，在加AP和TEMED之前最好对溶液进行抽气，以防止溶解在溶液里的分子氧在聚合时产生气泡使胶不均一。2，AP和TEMED的量应根据室温和聚合情况而定。3，分离胶聚合后最好在4℃下放置12h后再用，以使凝胶充分聚合，改善电泳时的分辨率。4，为防止气泡陷入，梳子应倾斜插入。5，如果带着梳子过夜可能会影响分辨率，所以浓缩最好在使用前再灌制。6，如