七种水蛭组织细胞可溶性蛋白sds-page电泳分析

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1、七种水姪组织细胞可溶性蛋白SDS-PAGE电泳分析摘要：采用垂直平板十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法对我国7种常见水姪的组织细胞可溶性蛋白成分进行电泳图谱特性分析。结果表明，7种水蛭组织细胞中可溶性蛋白的SDS—PAGE图谱中多数条带相同，但也存在差异。其中日本医蛭蛋白条带最多，达28个，并且吸血姪类的蛋白条数要明显大于非吸血姪类，而3种不同地理分布的菲牛姪间表达蛋白图谱无明显差异。该研究为在分子水平分析我国水姪不同种类、同种不同地理分布及不同食性间的差异积累了新的生物学数据，对其分类和药材鉴别提供了参考依据。关键词：水蛭；可溶性蛋白；十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电

2、泳中图分类号：Q503文献标识码：A文章编号：0439-811416-3423-03AnalysisofSolubleProteinsinHistiocyteofSevenWANGBol，ZHANGBin2,GONGYuan3,YUXiang4,L?^BJun—yi5Abstract：Thehistiocytesolubleproteinsofseven1eechesinChinawereanalyzedthroughSDS—PAGE.Theresu1tsshowedthattheseven1eechspeciessharedmostofthesolubleprotein

3、scomponentsofhistiocyte；whileafewdifferencesexisted.HirudonipponiaWhitmanhadthe1argestnumberofproteinbandsof28.Thereweremoreproteinbandsofblood—suckingleechesthanthatofnon—bloodsuckingleeches.NosignificantdifferencewasdetectedamongthehistiocytesolubleproteinscomponentsofH.manillensisLesso

4、nfromthreedifferentareas.ItwasprovedthatSDS—PAGEcouldbeusedforclassificationandidentificationofleechesofdifferentvarieties,geographicdistributionandfoodhabitatthemolecularlevel,anditaccumulateddatabaseofbiologicalpropertKeywords：leech;soluble—protein；SDS—PAGE水姪具有医用价值，其药效在《神农本草经》中就有记载，它有破血

5、、逐瘀、通经的功效，主要用于治疗瘤症、痞块、血瘀、闭经和跌打损伤［1］。水姪种类繁多，全世界记载命名的有680多种，其中我国有记录的姪类就达100余种［2，3］。我国有医用价值的姪类主要集中在医姪形亚目的医姪科、黄姪科和山姪科［1，4］。我国最新药典规定的药用水蛭有3种：蚂蟥、柳叶蚂蟥、水蛭，它们分属于黄姪科和医蛭科［5］。在国内水姪药材市场，一般通过形态学特征加以鉴定，易造成人为的误判，因此有必要通过理化和分子手段来进行水姪药材的辅助鉴别。目前，有通过薄层层析和蛋白电泳方法来对历版药典收录的3种水姪炮制品进行鉴别的报道［6—8］，而针对水蛭活体的鉴别研究仅有关于日本医姪

6、和天目山姪4种同工酶蛋白电泳比较研究的报道［9］。试验采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对我国7种不同食性和地理分布的水姪活体组织细胞可溶性蛋白表达特征及差异进行了分析，为水蛭资源分析、种类鉴定和种类间遗传多样性分析提供一定参考。1材料与方法1.1试验材料宽体金线蛭和光润金线蛭产于江苏省宿迁市，尖细金线蛭产于山东省鱼台县，日本医蛭产于湖北省公安县，3种野生菲牛姪分别产于广东省清远市、广西壮族自治区钦州市和海南省琼中县。1.2试验试剂丙烯酰胺、N，N_亚甲基双丙烯酰胺、303和0—巯基乙醇等购自Sigma公司；过硫酸铵、N,N，N'，N'-四甲基乙二胺、Tris碱、

7、溴酚蓝、冰醋酸和考马斯亮蓝R—250等购自广州威佳生物科技有限公司；RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物科技有限公司。1.3蛋白样品制备及纯化①活体水蛭低温处死后将其肠道翻出，用去离子水洗净内容物，把组织剪切成细小的碎末，用研钵在液氮条件下将样品研磨成细粉末状[9];②取适量RIPA裂解液，在使用前数分钟内加入苯甲基磺酰氟，使其最终浓度为1mmol/L；按每20mg组织加入150〜250piL裂解液的比例加入裂解液；③用玻璃匀浆器匀浆至充分裂解后，将组织悬液在4°C,8000r/min离心10min;④小心避