NaCl胁迫下嫁接黄瓜叶片可溶性蛋白质的双向电泳分析

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1、http://www.paper.edu.cnNaCl胁迫下嫁接黄瓜叶片可溶性蛋白质1的双向电泳分析杨立飞，朱月林,胡春梅南京农业大学园艺学院,江苏南京210095Email:ylzhu@njau.edu.cn摘要：以日本引进的耐盐品种帝王新土佐南瓜为砧木、津研4号黄瓜为接穗，对嫁接植株和接穗自根植株在NaCl胁迫下叶片可溶性蛋白质进行双向电泳对比研究。结果表明，NaCl处理后2d在嫁接植株叶片内产生了9个与胁迫有关的特异蛋白质点，其表观分子量分别为68.8kD、39.6kD、35.2kD、33.4kD、32.1kD、19.8kD、16.

2、6kD、15.4kD、12.9kD。对分子量为39.6kD（编号为2）的蛋白质点进行了基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）分析，并对结果在SwissProt45.2蛋白质数据库中进行搜索，发现其与甲基转移酶(O-methyltransferase)相匹配[序列号为P47917;分子量(Mw）为39.58kD;等电点(PI)为5.54]。甲基转移酶与植物的耐盐性有关。此外，在嫁接植株叶片内的其余多数蛋白质，均表现出表达上调。以上结果表明，嫁接苗在NaCl胁迫下不仅产生了一系列新的蛋白质，而且在其余多数蛋白质的合成上均

3、表现出上调趋势,从而增强其耐盐性。关键词：黄瓜；嫁接；盐胁迫；双向电泳1.引言近年来，我国的黄瓜设施栽培面积日益扩大，然而随着种植年限的增加、生产者栽培管理措施不当等原因，土壤盐分积累已成为黄瓜设施栽培中的一个严重问题。土壤的次生盐渍[1-3]化导致黄瓜的生长发育受到抑制，严重影响其产量和品质。黄瓜的嫁接栽培是克服设施土壤次生盐渍化的一条有效途径，嫁接换根提高植株耐盐性。以往对嫁接黄瓜的研究主要集中在嫁接优势方面，尚未在蛋白质分子水平上对产生嫁接优势的机制进行研究。尽管对[4]黄瓜嫁接愈合过程中产生的一些特异蛋白质有所报道，但对于嫁接黄瓜

4、在盐胁迫条件下产生的与盐胁迫有关的蛋白质尚未见报道。本文用等电聚焦聚丙烯酰胺凝胶双向电泳（IEF-SDS-PAGE）对NaCl胁迫下黄瓜嫁接苗和自根苗叶片可溶性蛋白质进行对比研究，旨在探明嫁接黄瓜提高耐盐性的蛋白质分子生物学机理，为更好地利用嫁接换根技术提高黄瓜耐盐性提供理论基础。2.材料与方法1基金项目：江苏省科技厅资助项目（BC2003306）,教育部留学回国基金资助项目（[2001]498）1http://www.paper.edu.cn2.1材料供试的黄瓜（CucumissativusL.）接穗品种为津研4号（山东宁阳蔬菜良种有限

5、公司培育）。砧木为帝王新土佐南瓜（Cucurbitamaxima×C.moschata），购自日本Tokita种苗公司。2.2方法2.2.1试材培育2004年9月11号在南京农业大学的玻璃温室内播种黄瓜，9月13号播帝王新土佐南瓜，均播于装有蛭石的直径10cm，高10cm的塑料营养钵中。子叶展开后每隔2d浇1/4浓度日-1本园试营养液（EC值为0.93dS•m）。9月26号用劈接法进行嫁接，此时黑籽南瓜子叶完全展开，第1片真叶长至0.3～0.5cm，黄瓜子叶充分展开，心叶微露。嫁接操作和嫁接苗的[5,6]培育按我们以前报道的方法进行。10

6、月9号将嫁接苗移栽至上直径39cm、下直径26cm、高33cm的塑料桶中，每桶装12L营养液，用厚度为3cm的泡沫塑料板做成圆形盖子,覆盖在塑料桶顶部,在盖的中央挖1个直径为3cm的小孔,用海绵包裹幼苗下胚轴,然后植入盖子中央的孔中,每桶栽1株，用1/4浓度日本园试营养液进行栽培，电动气泵进行24h连续通气，每5天更换一次营养液。2.2.2试验处理-110月20日，当植株具有8片真叶时进行NaCl胁迫处理，NaCl浓度为100mmol·L，溶解于1/4浓度日本园试营养液中。试验设2个处理：①津研4号自根植株+NaCl（编号为A），②津研4

7、号与帝王新土佐南瓜的嫁接植株+NaCl（编号为B）。每处理不少于10株，在温室内随机排列。[7][8]2.2.3蛋白质双向电泳参照Komatsu等(1999)和夏其昌等（2004）的方法略作修改。2.2.3.1叶片可溶性蛋白的提取：NaCl处理后2d，挑选生长整齐一致的嫁接苗和自根苗各5株，在上数倒数第4片完全[9]展开的真叶上用直径1cm的打孔器分别取样。可溶性蛋白质的提取参照朱友林等的方法。取1g黄瓜叶片，液氮中研磨成细粉后转移到离心管中，加入样品提取液（10%三氯乙酸，0.07%β-巯基乙醇的丙酮溶液），充分振荡，-20℃下沉淀1h

8、，4℃下12000rpm离心15min，弃上清液。再加4mL丙酮溶液悬浮沉淀。充分振荡后，-20℃下沉淀1h。重复此步骤一次。4℃下12000rpm离心15min，弃上清液后冰冻真空干燥沉淀。