DsRNA对小鼠肝细胞干扰素-α的表达影响-论文.pdf

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1、HEILONGJIANGMEDICINEANDPHARMACYOct．2013，Vo1．36No．5·39·DsRNA对小鼠肝细胞干扰素一Q的表达影响张虎，杜欣娜。，张淑红，朱金玲，李春明。，赵璐，胡新俊(1．佳木斯大学基础医学院，黑龙江佳木斯154007；2．佳木斯大学附属第二医院，黑龙江佳木斯154002f3．佳木斯中心医院，黑龙江佳木斯154002)摘要：目的：探讨香菇天然dsRNA影响小鼠肝细胞干扰素一n表达变化机制。方法：纤维素柱层析法提取新鲜香菇天然dsRNA，按不同剂量dsRNA(O．5、5、50mg·kg_1)腹腔注射小鼠，RT—PCR法检测肝脏干扰素一a的生成。

2、结果：实验组小鼠肝细胞中干扰素一QmRNA生成较对照组升高显著(P<0．05)。结论：香菇提取dsRNA可以显著增加小鼠肝细胞干扰素一amRNA的表达。关键词：dsRNA；肝细胞；干扰素一a；香菇中图分类号：Q52文献标识码：A文章编号：1008一O104(2013)05—0039一O1干扰素(Interferon，IFN)主要是糖蛋白，功能多样，具有TRIZOL法提取总RNA，操作步骤完全按照Invitrogen免疫活性。干扰素在抗病毒、增强免疫力和治疗肿瘤方面作公司的说明书进行。用巨大。一直以来干扰素一直是生命科学领域的研究重点和1．2．2．3RT-PCR检测干扰素一amRN

3、A的表达热点。但是在临床上，干扰素的不足之处在于半衰期短，且容①反转录：依据试剂盒说明书2OL反应体系：易产生副作用。寻找合适的干扰素诱导剂成为了当今研究的总RNA：2g；10×反转录缓冲液：2L；100mMdNTP：焦点[1]。本课题研究了新鲜香菇dsRNA对于小鼠肝脏细胞0．8／~L；10×反转录随机引物：2／~L；50u／~L反转录酶：lp．L；的干扰素一a的表达影响，初步探讨其中的机制，为寻找合适40u／~LRNA酶抑制剂：0．5L；DEPC处理过的去离子水：的干扰素诱导剂提供前期基础。补至20／,L。1材料与方法反转录条件：25℃10min，37℃120min，85℃5

4、sea，1．1实验材料反转录后的cDNA-20~C保存待用。②PCR扩增：IFN—q引物序列：上游5’CTGT-佳木斯大学动物中心提供小鼠30只，体重(20士4)g，随GCTTTCCTGATGGT3’，下游5’GAGTCTAG—机分为对照组和实验组。新鲜香菇购买于佳木斯市大润发超GAGGGTTGTATT3’，产物大小：309bp；市。GAPDH引物序列：1．2实验方法上游5’GGGTGATGCTGGTGCTGAGTATGT3’，1．2．1DsRNA的提取和鉴定下游5’AAGAATGGGAGTTGCTGTTGAAGTC3’，参考文献[2]，取新鲜香菇10g，液氮研磨，加入2倍体积产

5、物大小：700bp。的STE及酚／氯仿／异戊醇混合液抽提；2000rpm离心；取上PCR反应体系(2OL)：cDNA：1L；2×Mix液：lOlL；清液，加入无水乙醇至终浓度的17，注入预处理过的纤维FP：0．5~L；RP：0．5L；无菌双蒸水：补至2OL素(CF一Ⅱ)柱中，最后用80mL含17乙醇的1倍体积的PCR反应条件：STE液洗脱，再用不含乙醇的1倍体积的STE液洗脱；洗脱95℃5min，95℃30sec，56℃30sec，72℃50sec，28个循液用异丙醇、乙醇沉淀，真空抽干，得到dsRNA。环，72℃5min．1．2．2RT-PCR检测干扰素一dmRNA的表达变化1

6、．3统计学处理1．2．2．1动物处理实验所得数据采用SPSS18．0软件进行t检验，计量资对照组小鼠不做任何处理，实验组小鼠分为dsRNA注料以土s表示，尸<0．05表示差异具显著。射0．5、5和50mg·kg三个组，12h后猝死所有小鼠，取肝脏，2结果液氮保存，备用。见表1。1．2．2．2小鼠肝脏总RNA提取表1不同组间干扰素一amRNA表达变化(n=6，士s)注：尸<0．01vs对照组；P<0．01vs0．5mg·kg；8LP

7、年人们首次发现干扰素，生物学活性广泛，具有广同的细胞信号途径来激活机体的非特异性免疫应答。这其谱的抗病毒、免疫调节和抗肿瘤作用，组成了机体防御的重中，比较最重要的是TLR3途径和RNA解旋酶RIG—I／要部分。IFN—a不能直接清除宿主病毒，而是通过抑制病毒MDA5途径[6]。本实验提取新鲜香菇天然dsRNA，以不同浓复制来完成抗病毒作用，所以临床上一旦停止使用干扰素，度作用于小鼠，RT-PCR检测了肝脏细胞内IFN—a的表达往往病情反复，甚至恶化。另外，干扰素容易产生副作用，长