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1、达肝清对小鼠肝细胞异常凋亡的影响论文【摘要】目的探讨中药复方达肝清对苯巴比妥钠诱导的小鼠肝细胞异常凋亡的影响，进一步揭示其抗肝损伤的作用机理。方法采用撤除苯巴比妥钠（PB）诱导小鼠肝细胞凋亡的模型；通过流式细胞检测技术，TUNEL原位检测法，HE常规染色等方法，以肝细胞凋亡率、肝组织形态、原位细胞TUNEL反应、肝/体重比为指标，观察不同剂量达肝清对PB诱导肝细胞凋亡的影响。结果流式细胞仪分析表明，达肝清高、中剂量组肝细胞凋亡率明显低于凋亡对照组；达肝清高剂量组肝/体重比回落明显低于凋亡对照组；组织学染色及TUNEL反应，凋亡对照组可见凋亡小体.freelice,andtoresearcht
2、hemechanismofitspreventingacuteliverinjury.MethodsTheapoptosismodeloflivercellsinmicecausedbyphenobarbitaledtocheckthechangesinapoptoticcells.Therateofhepatocyteapoptosis,thehepatichistopathologicchanges,tunnelchangeandliverbodyetryanalysisrevealedthattheapoptoticrateoflivercellsandliverbodyiddledo
3、segroupsoreconspicuous,andthenumberofapoptoticcelloreinpositivegroupthanothergroups.ConclusionChineseherbpoundDaganqinginthedosagesof34g/kg，17g/kgcanobviouslyinhibitthelivercellapoptosiscausedbyphenobarbitalaybeoneofthemechanismsofDaganqingpreventingacuteliverinjury.Keya公司）,TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（德国RocheAp
4、pliedScience公司），其余试剂均为国产分析纯。1.4仪器显微镜（德国Leica公司），TGL-16M低温超速离心机（湖南塞特湘仪有限公司），EL204电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司），HH-8数显恒温水浴锅(国华电器有限公司),EPICSXL型流式细胞仪（美国BeckmanCoulter公司）。2方法2.1动物分组及处理小鼠60只，雌雄各半，共分为6组，每组10只，分别为空白对照组,非凋亡对照组，凋亡对照组，达肝清高剂量组(34g/kg)，达肝清中剂量组(17g/kg)，达肝清低剂量组(8.5g/kg)。空白对照组ip无菌生理盐水，0.15ml/10g，1次/d，连续7d
5、；非凋亡对照组ip0.5%PB，0.8mg/10g，0.15ml/10g，1次/d，连续7d；凋亡对照组ip0.5%PB,0.8mg/10g,0.15ml/10g，1次/d，连续6d。其余各药物组，首先ip0.5%PB，0.8mg/10g，0.15ml/10g，1次/d，连续6d。从撤除PB开始灌胃给药，0.2ml/10g，1次/6h，至停PB后36h。将所有小鼠脱颈处死，取肝组织。2.2流式细胞仪分析取小鼠肝组织，分离肝细胞，用PBS洗涤细胞1次（离心2000r/min，5min）收集并调整细胞浓度为1×106/ml；细胞加9倍体积的70%冰乙醇,于-20℃固定至少12h；离心收集细胞后，
6、用PBS洗细胞以除去乙醇，细胞重悬于500μlPBS中；加入RNaseA，使其终浓度为0.25mg/ml,37℃,反应30min；加入5μlPI室温避光染色30min；流式细胞仪检测凋亡率。2.3肝/体重比及组织学染色取小鼠全部肝组织,沾除血渍,测肝重,计算肝/体质量比。取肝组织,中性福尔马林固定,石蜡包埋,切片,HE染色,光镜下观察，高倍镜下随机选取10个高倍视野，观察其形态学变化，计数凋亡细胞。2.4TUNEL反应按照RocheAppliedScience公司TUNEL细胞凋亡检测试剂盒说明书操作步骤进行，光镜下观察，高倍镜下随机选取10个高倍视野，观察凋亡细胞形态并计数凋亡细胞。2.5
7、统计学处理所有数据通过SPSS11.0统计软件处理，计量资料以±s表示,两组间比较采用t检验,P0.05认为有统计学差异。3结果3.1流式细胞仪分析凋亡率流式细胞仪分析表明（见表1），凋亡对照组凋亡率明显高于空白对照组及非凋亡对照组（P＜0.01）；与凋亡对照组比较，达肝清高、中剂量组肝细胞凋亡率有显著差异（P＜0.01），达肝清低剂量组肝细胞凋亡率虽低于凋亡对照组但无显著性差异（P＞0.05）。表1流式细胞
