小牛肝提取物对新生小鼠肝细胞损伤的影响

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1、小牛肝提取物对新生小鼠肝细胞损伤的影响【摘要】目的研究不同浓度的小牛肝提取物对新生小鼠肝细胞损伤的影响。方法采用Ⅳ型胶原酶消化法制备游离肝细胞悬液，以低血清进行肝细胞原代培养，12～16h后用0.1mmol/L的H2O2诱导肝细胞损伤，同时加以不同浓度的肝提取物，观察(100～1000)mg/L的小牛肝提取物对肝细胞损伤的影响。结果小牛肝提取物在100mg/L时即可起到保护肝细胞损伤的作用，但效果不明显，在500mg/L时可明显保护肝细胞损伤，之后随着浓度的加大保护作用逐渐减弱。结论小牛肝提取物对H2O2诱导的肝细胞损伤具有一定的保护作用，其中

2、以浓度为500mg/L时效果最明显。【关键词】小牛肝提取物H2O2肝细胞培养肝细胞损伤保护作用　　Abstract：ObjectiveTostudytheeffectofdifferentconcentrationsofcalfliverextractonthedamageoftheneonatalmicehepatocytes.MethodsHepatocytesweredigestedbyIV-Collagenaseandculturedwithlow-serummedium,inducedbyH2O2after12～16h.Various

3、concentrationsofcalfliverextractwereaddedtotheprimaryculturedhepatocytestoobservetheeffectof(100～1000)mg/Lcalfliverextractontheinjuredlivercell.ResultsCalfliverextractat100mg/L11couldprotectthehepatocytesfrominjury,buttheeffectwasnotobvious.At500mg/L,calfliverextractcouldpro

4、tectthehepatocytesobviously.Withincreasingconcentration,theprotectiveeffectweakenedgradually.ConclusionsCalfliverextractcouldprotecthepatocytesfromdamageinducedbyH2O2,theeffectataconcentrationof500mg/Lwasthemostobvious.Keywords：calfliverextract;H2O2;hepatocytesculture;hepato

5、cytesinjured;protectiveeffect小牛肝提取物以小牛肝为主要原料,经物理方法提取的小分子蛋白质，含有丰富的维生素B2、B12、叶酸、肝细胞刺激因子、嘌呤核苷和各种氨基酸，整体实验已证实对急性肝损伤具有保护作用［1］。为进一步研究肝提取物的保肝作用，本文采用Ⅳ型胶原酶消化法分离肝细胞进行体外培养，用H2O2体外诱导肝细胞氧化损伤模型，在细胞水平上证实小牛肝提取物对肝细胞损伤的保护作用，为生物药的研发和应用提供可靠依据。1材料　　1.1实验动物11　　昆明株1～3d新生小鼠，雌雄不限（辽宁医学院实验动物中心提供）　　1.2药

6、品与试剂　　小牛肝提取物；D-Hanks液；Ⅳ型胶原酶（美国Sigma公司）；RPMI-1640（北京赛驰生物科技有限公司）；青霉素100μg/mL，链霉素100μg/mL；H2O2、胎牛血清（锦州奥鸿药业有限责任公司）；细胞培养板；MTT试剂盒、ALT试剂盒、MDA试剂盒、SOD试剂盒（南京建成生物工程研究所）2方法　　2.1小牛肝提取物的制备　　取1kg小牛肝，按文献［2］的方法制备提取物。提取物呈微黄色粘稠状液体，味腥；照分光光度法测定，在285nm的波长处有最大吸收；pH值应为6.0～7.5；-20℃保存。　　2.2新生小鼠肝细胞的分离

7、与培养按文献［3］，将乳鼠于75%酒精中浸洗1011s后断头处死，迅速取出肝脏置于含有双抗的4℃的D-Hnaks液中漂洗去除血污，剥除被膜和血管等纤维成份，用剪刀将肝组织剪成1mm3左右的小块，再倒入4℃D-Hanks液试管中，吸管吹打，待组织沉淀后吸出上清，如此反复3次后，加入0.2%Ⅳ型胶原酶，4℃冰箱放置6～7h。消化完全者可用吸管吹打散开，悬液经200目尼龙网过滤,得到悬液中加入含10%胎牛血清的完全培养基，于4℃冰箱中静置30min，多数上皮细胞沉于管底，而血细胞及碎片仍多浮于悬液中，弃悬液，加入RPMI-1640培养基，以1000r

8、/min离心4min，反复3次，最后加入含10%胎牛血清的完全培养基，以1×106cell/mL接种于培养板。10h后首次换液，换以5%胎牛血清的培养