乙醇对小鼠原代肝细胞脂肪酸氧化速度的影响论文

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1、乙醇对小鼠原代肝细胞脂肪酸氧化速度的影响论文.freelmol/L乙醇存在的情况下，通过3H标记的棕榈酸（C16:0）检测肝细胞的脂肪酸氧化速度。结果成功地分离了肝细胞，肝细胞的存活率≥95%。肝细胞在体外培养48h仍能够保持良好的生长状态。对肝细胞脂肪酸氧化速度的研究发现，20mmol/L酒精能够导致肝细胞的脂肪酸氧化速度降低40%左右，导致肝细胞中脂肪含量增加。结论本研究成功地建立肝细胞的体外培养方法.freeliceprimaryhepatocytes【Abstract】ObjectiveToisolatethe

2、miceprimaryhepatocytes，andthecellseasured.MethodsThemousearyhepatocytesorphologyofculturedprimaryhepatocyteseasuredusing［9，10-3H］palmiticacid(C16:0)asatracer.ResultsTheprimaryhepatocytesorethan95%.20mmol/Lethanolcouldreducethespeedoffattyacidβ-oxidationabout40%，

3、andleadtotheincreasedlipidlevelinhepatocytes.ConclusionEGTA和0.1%葡萄糖的Kreb-Ringer缓冲液灌注肝脏，同时迅速切断门静脉使灌注液从门静脉流出，灌注压力为20cm水柱，灌注速度为4ml/min；灌注20ml后更换含有0.5mg/ml胶原酶和5mMCaCl2的灌注液继续灌注10min，立刻小心取出肝脏，置于含有Kreb-Ringer缓冲液的10mM培养皿中，用剪刀剪开肝脏包膜，轻轻晃动使肝细胞释放出来；采用70μm的细胞滤器过滤；使用10%FBS的DM

4、EM洗涤细胞2次，50×g离心。1.3存活性鉴定分离后的肝细胞立刻用4%台盼蓝染色，在显微镜下观察，核呈蓝色为死细胞，拒染的细胞为活细胞，将细胞接种于胶原包被的12孔培养皿中，采用含有10%胎牛血清，100u/ml青霉素和链霉素的DMEM培养液，在5%CO2，37°C培养。1.4形态学观察（1）脂肪染色：取不同培养时间的肝细胞，4%多聚醛溶液固定，油红O（OilRedO）染色，再用苏木精衬染细胞核，缓冲甘油封片后，观察肝细胞中脂肪的含量。（2）苏木精-伊红（HE）染色：固定的肝细胞用苏木精-伊红染色，脱水透明后，观察不

5、同生长时间的细胞形态变化。1.5脂肪酸氧化速度肝细胞脂肪酸氧化速度根据文献进行［1］，将分离的肝细胞接种到12孔细胞培养板中，2×105/孔，细胞贴壁12h后开始测定肝细胞脂肪酸的氧化速度。先用PBS洗涤细胞2次，每孔加入500μl含有0.5mg/mlBSA，22μM［9，10(n)-3H］棕榈酸(1μCi/孔)的Hanks液，试验孔中同时加入20mM乙醇，每组3个复孔。37°C培养2h后将培养液立即转移到玻璃试管中，并采用0.5mlHanks液洗涤细胞2次，将洗涤液也加入玻璃试管中。采用Folch法抽提脂肪酸，每管中

6、加入8ml甲醇/氯仿(2:1)和0.5ml2MKCl/2MHCl溶液。剧烈混合30min后离心，将上层水相转移到一个新的玻璃试管中，继续采用甲醇/氯仿抽提一次，将水相转移到闪烁瓶中，加入10ml闪烁液，混合后采用闪烁计数器测定脂肪酸氧化后生成的3H2O量。肝细胞的蛋白含量采用Brad-ford法进行测定。2结果2.1分离肝细胞存活率肝细胞分离的存活率，大于95%。2.2形态学观察结果分离的肝细胞，在培养12h后即能够充分贴壁生长。肝细胞在生长的早期（24～48h）细胞状态较好，可见明显细胞极性，细胞排列生长（图1A）。

7、细胞生长后期（4天），肝细胞生长出现排列紊乱，细胞突触增多（图1B），并可见细胞分裂像（图1C）。图1体外培养的肝细胞形态Fig1themorphologyofculturedprimaryhepatocytesA:Cultured24hr;B:Cultured96hr;C:thedivisionthehepatocytes2.3乙醇对肝细胞脂肪酸氧化速度的影响乙醇能够明显抑制肝细胞的脂肪酸氧化速度，正常培养的肝细胞脂肪酸氧化速度为3.12nmol/mgprotein/h，而在20mmol/L的乙醇存在的情况下脂肪酸氧

8、化速度为1.76pmol/mgprotein/h，降低约40%左右，具体结果见图2。图2乙醇对体外培养肝细胞脂肪酸氧化速度的影响Fig2Theeffectofethanoltotherateoffattyacidoxidationofculturedhepatocytes2.4肝细胞中的脂肪含量通过油红O染色可见，肝细胞在20mm