血小板反应蛋白1对小鼠原代肝细胞脂代谢的影响

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1、单位代码10475学号104753130980分类号R3硕士学位论文血小板反应蛋白1对小鼠原代肝细胞脂代谢的影响学科、专业：生物化学与分子生物学研究方向：代谢性疾病申请学位类别：理学硕士申请人：姚玲指导教师：李彦章教授王淑霞教授（美国肯塔基大学）二〇一七年四月EFFECTSOFTHROMBOSPONDIN1(TSP1)ONPRIMARYHEPATOCYTEMETABOLISMINMICEADissertationSubmittedtotheGraduateSchoolofHenanUniversityinPartialFulfil

2、lmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofMedicineByLingyaoSupervisor:Prof.YanzhangLiProf.ShuxiaWang(UniversityofKentucky)April,2017I摘要背景：近年来，非酒精性脂肪肝（Non-alcoholicfattyliverdisease，NAFLD）是世界上最普遍的慢性肝脏疾病。而有很多种原因可以引起非酒精性脂肪肝，胰岛素抵抗与非酒精性脂肪肝的危险因素关系很密切，几乎大部分的非酒精性脂肪肝患者都存在有在周

3、围组织和肝脏的胰岛素抵抗，并且胰岛素抵抗的严重程度与非酒精性脂肪肝的病情进展相关。因此，胰岛素抵抗在非酒精性脂肪肝的发病机制中起着很重要的作用。发现，在肥胖和胰岛素抵抗的患者体内，血小板反应蛋白1（TSP1）被高度表达，并且和脂肪组织的炎症非常相关。根据文献，在高脂饮食诱导肥胖的小鼠模型中，相较于野生型小鼠，TSP1基因的缺失可以显著的提高胰岛素的敏感性并减少有关的炎症；可以改善高脂饮食诱导的肝脏的脂滴蓄积，以及脂肪性肝炎。肝脏作为胰岛素作用的位点之一，也是脂质代谢的重要器官。但是，TSP1是否减弱了肝细胞对胰岛素的敏感性，TSP

4、1基因的缺失是否会改善肝细胞的脂质代谢，因此，本实验就选用野生型小鼠和TSP1基因缺失型小鼠作为研究对象，来探究TSP1蛋白是否会减弱肝脏细胞对胰岛素的敏感性，以及TSP1基因的缺失会改善原代肝细胞的脂质代谢。目的：探究TSP1在肝细胞对胰岛素敏感性中起的作用，以及TSP1基因的缺失对肝细胞脂质代谢的影响。方法：选用年龄相匹配的C57BL/6和TSP1基因缺失型的雌性小鼠，同时采用两步灌流法分离培养原代肝细胞。将从野生型小鼠体内分离得到的原代肝细胞分为对照组，胰岛素刺激组，TSP1蛋白处理组，TSP1蛋白处理+胰岛素刺激组；对于T

5、SP基因缺失型小鼠原代肝细胞，被分为：对照组，胰岛素刺激组。用全培养基培养细胞过夜贴壁生长后，用PBS洗细胞两次，在无血清培养基中过夜处理后，在TSP1处理组中，用2ug/mlTSP1蛋白孵育细胞3h和24h，用10nm和100nm人胰岛素处理10min，在实验处理完毕之后，收集蛋白以及RNA，用来检测P-AKT，炎症因子等指标。对于脂肪酸诱导体外实验，将实验组分为：对照组，脂肪酸处理组，BSA对照组。将过夜培养贴壁细胞，更换无血清培养基，包含溶于10%BSA的200umFFA，处理细胞24h。（BSA对照组是含有与脂肪酸等体积的

6、II10%BSA）可用于油红染色，将细胞在KrebsRingerBuffer中裂解，用试剂盒来测细胞内甘油三酯的含量，以及检测活性氧（ROS）的含量。结果：1.加过TSP1蛋白处理的野生型小鼠的原代肝脏细胞，相较于对照组，P-AKT的蛋白表达降低，2.相较于野生型小鼠，TSP1基因的缺失使肝细胞中P-AKT的表达明显的增高。3.对于脂肪酸诱导的体外实验，200umFFA处理后，相较于野生型小鼠，TSP1基因的缺失使肝细胞的甘油三脂含量明显降低。结论：1.TSP1基因的缺失减少了小鼠肝脏和原代肝细胞中脂滴蓄积。可能是通过脂肪酸摄取和

7、脂肪合成减少来实现的。2.TSP1基因的缺失增加了原代肝细胞对胰岛素的敏感性；减少了细胞的氧化压力，并减少了炎症因子的表达。关键词：原代肝细胞，脂质代谢，胰岛素，TSP1IIIABSTRACTBACKGROUND:Non-alcoholicfattyliver(Non-alcoholicfattyliverdisease,NAFLD)isnowthemostcommonchronicliverdiseaseintheworld.Non-alcoholicfattyliveriscausedbyavarietyofreason,in

8、sulinresistanceandnon-alcoholicfattyliverriskfactorsarecloselyrelated.Recentstudieshaveshownthatalmostmostofthenon-alcoholic