硫化氢对小鼠原代肝细胞脂肪合成和分解的影响

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1、单位代码１０４７５学号１０４７５３１２１０４２分类号Ｒ３６１皆為乂聲硕±学位论文硫化氨对小鼠原代肝细胞脂肪合成和分解的影响学科、专业：病理学与病理生理学研究方向：代谢综合症申请学位类别：医学硕±？申请人；张化敬指导教师：皇甫超申教授李彦章教授二〇－五年五月InfluenceofHydrogenSulfideontheLipidSynthesisandDecompositionofMouseprimaryHepatocytesADissertationSubmittedtotheG

2、raduateSchoolofHenanUniversityinPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofMedicineByYoujingZhangSupervisor:Prof.ChaoshenHuangfuProf.YanzhangLiMarch,2015摘要背景：非酒精性脂肪性肝病（Non-alcoholicfattyliverdisease，NAFLD）是代谢综合症中常见的一种疾病，现已成为欧美等发达国家和我国慢性肝病的重要病因，目前还没有理想的预防和治疗药物

3、。在NAFLD的发病机制中，由胰岛素抵抗及其它因素引起的肝脏内脂质合成增加及沉积在疾病的发生发展中占据重要地位。硫化氢（Hydrogensulfide），化学分子式为H2S，是一种能在人类和哺乳动物细胞内合成的气体分子递质，可调控多种生理及病理生理过程。有研究显示，内源性H2S或外源性H2S供体的补充，可在生理或病理生理条件下影响肝脏正常的脂质代谢。然而，H2S改变及控制肝脏脂质代谢的机制尚不清楚。有文献报道在大鼠脂肪细胞中，抑制胱硫醚γ裂解酶（Cystathionine-gamma-lyase，CSE）/H2S系统可通过PKA-脂肪包被蛋

4、白/激素敏感性脂肪酶（Hormonesensitivelipase，HSL）途径增强脂肪分解作用，增加血脂水平，从而使肝细胞内脂质负荷增加，患NAFLD风险增加。而给予H2S供体则会降低脂肪细胞内的脂肪分解作用，这样就有可能降低NAFLD风险。由此课题组推测，外源性H2S可能会影响到肝细胞内脂肪的合成及分解代谢。肝细胞内脂肪过度蓄积可以抑制细胞自噬，H2S作为一种气体分子递质，可激活细胞自噬，但是否能通过改变肝细胞的自噬水平来调节肝细胞的脂肪代谢目前还不清楚。目的：探究H2S对肝细胞脂肪合成和分解代谢的影响以及细胞自噬对肝细胞脂肪变性的影响

5、，为进一步了解H2S在NAFLD的作用及开发H2S供体治疗药物提供理论依据。方法：两步原位灌流法分离培养C57BL/6小鼠原代肝细胞，体外用油酸（Oleicacid，OA）诱导肝细胞脂肪变性模型。研究H2S对肝细胞脂质合成影响时细胞分四组：对照组，给予等体积的培养液和10%的BSA，用于替换模型组所用的含1.2mmol/L的油酸（溶于10%的BSA）的培养液；模型组，用含1.2mmol/L油酸（溶于10%的BSA）的培养液孵育原代肝细胞48h；H2S组和PAG组是指用含1.2mmol/L油酸（溶于10%的BSA）的培养液孵育原代肝细胞的同时

6、分别给予1mMGYY4137和200μMPAG处理48h。油红染色观察细胞内脂滴变化情况，比色法检测细胞内甘油三酯（TG）含量，观察脂肪分解的实验也分四组：对照组，给予等体积的培养液和10%的BSA，用于替换模型组所I用的含1.2mmol/L油酸（溶于10%的BSA）的培养液；模型组，用含1.2mmol/L油酸（溶于10%的BSA）的培养液孵育原代肝细胞48h；H2S组和PAG组是用含1.2mmol/L油酸（溶于10%的BSA）的培养液孵育原代肝细胞48h，然后换无血清无酚红的RPMI1640培养液同时分别给予1mMGYY4137和200μ

7、MPAG处理6h。实验结束时，收集各组细胞培养液检测其中甘油含量，取细胞爬片做LC3免疫荧光，拍摄相差图片；同时离心收集细胞制作电镜标本；用Westernblotting方法检测细胞中LC3A/B、HSL和p-HSL的蛋白表达量。结果：1.用含油酸浓度为1.2mmol/L的培养液诱导肝细胞48h，油红染色显示细胞体积增大，轮廓模糊，胞质中有大量脂滴形成，小鼠原代肝细胞脂肪变性模型建立成功。2.在观察脂肪合成的实验中，与对照组相比，模型组肝细胞中甘油三酯含量明显增高（P<0.05）；而与模型组相比，H2S组和PAG组肝细胞中TG含量无明显变化

8、。3.在观察脂肪分解的实验中，与对照组相比，模型组甘油释放量显著增加（P<0.05），，H2S组与模型组相比甘油释放量显著减少（P<0.05）.Westernblotting结果