乙醇对小鼠原代肝细胞脂肪酸氧化速度的影响

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1、乙醇对小鼠原代肝细胞脂肪酸氧化速度的影响【摘要】目的建立小鼠肝细胞的体外培养方法，同时检测乙醇对肝细胞脂肪酸β-氧化速度的影响。方法采用戊巴比妥麻醉小鼠，通过肝脏灌注和胶原酶消化分离小鼠肝细胞，接种于胶原包被的培养皿中进行体外培养。通过HE染色观察细胞的生长状态。在20mmol/L乙醇存在的情况下，通过3H标记的棕榈酸（C16:0）检测肝细胞的脂肪酸氧化速度。结果成功地分离了肝细胞，肝细胞的存活率≥95%。肝细胞在体外培养48h仍能够保持良好的生长状态。对肝细胞脂肪酸氧化速度的研究发现，20mmol/L酒精能够导致肝细胞的脂肪酸氧化速度降低40%左右，

2、导致肝细胞中脂肪含量增加。结论本研究成功地建立肝细胞的体外培养方法，采用3H标记的脂肪酸能够敏感地检测脂肪酸氧化速度，而研究发现乙醇能够抑制肝细胞脂肪酸氧化速度。同时，本研究结果为肝细胞的脂肪和糖类代谢的研究提供了实验条件。【关键词】乙醇；肝细胞；脂肪酸Theeffectofethanolonfattyacidoxidationofmiceprimaryhepatocytes【Abstract】ObjectiveToisolatethemiceprimaryhepatocytes，andthecellseasured.MethodsThemousear

3、yhepatocytesorphologyofculturedprimaryhepatocyteseasuredusing［9，10-3H］palmiticacid(C16:0)asatracer.ResultsTheprimaryhepatocytesorethan95%.20mmol/Lethanolcouldreducethespeedoffattyacidβ-oxidationabout40%，andleadtotheincreasedlipidlevelinhepatocytes.ConclusionEGTA和0.1%葡萄糖的Kreb-Rin

4、ger缓冲液灌注肝脏，同时迅速切断门静脉使灌注液从门静脉流出，灌注压力为20cm水柱，灌注速度为4ml/min；灌注20ml后更换含有0.5mg/ml胶原酶和5mMCaCl2的灌注液继续灌注10min，立刻小心取出肝脏，置于含有Kreb-Ringer缓冲液的10mM培养皿中，用剪刀剪开肝脏包膜，轻轻晃动使肝细胞释放出来；采用70μm的细胞滤器过滤；使用10%FBS的DMEM洗涤细胞2次，50×g离心。1.3存活性鉴定分离后的肝细胞立刻用4%台盼蓝染色，在显微镜下观察，核呈蓝色为死细胞，拒染的细胞为活细胞，将细胞接种于胶原包被的12孔培养皿中，采用含有1

5、0%胎牛血清，100u/ml青霉素和链霉素的DMEM培养液，在5%CO2，37°C培养。1.4形态学观察（1）脂肪染色：取不同培养时间的肝细胞，4%多聚醛溶液固定，油红O（OilRedO）染色，再用苏木精衬染细胞核，缓冲甘油封片后，观察肝细胞中脂肪的含量。（2）苏木精-伊红（HE）染色：固定的肝细胞用苏木精-伊红染色，脱水透明后，观察不同生长时间的细胞形态变化。1.5脂肪酸氧化速度肝细胞脂肪酸氧化速度根据2.4肝细胞中的脂肪含量通过油红O染色可见，肝细胞在20mmol/L乙醇存在的情况下，培养6h后，肝细胞内的中性脂肪含量明显升高，见图3。图320mm

6、ol/L酒精处理6h后，肝细胞的油红O染色（40×）Fig3TheOilRedOstainingofhepatocytestreated6hmol/Lethanol(×40)A:Thehepatocytesmol/Lethanol.3结论随着中国经济的发展，在西方常见的酒精性肝病（alcoholicliverdisease，ALD）在我国的发病率也逐年提高。酒精为肝细胞损伤的重要因素，直接损害肝细胞线粒体、胞浆、内质网结构。酒精进入肝细胞内通过脱氢酶转变成乙醛，再通过乙醛脱氢酶（主要是线粒体酶）转换为乙酸。在此过程中氧化型辅酶I（NAD）减少，而还原型

7、辅酶I（NADH）增多，NAD/NADH比例降低，线粒体内三羧酸循环受到抑制，使肝细胞脂肪氧化作用减弱，产生活性氧(reactiveoxygenspecies，ROS)，肝内脂肪酸合成增多超过肝脏处理能力，从而形成脂肪肝，严重者进一步发展成为酒精性肝炎和肝硬化。乙醇在体内诱导产生“氧化应激（oxidativestress，OS）”状态，从而导致氧化还原环境的改变，一些有害活性物质的产生，金属离子的转运异常，线粒体的损害，细胞缺氧，甚至免疫系统的损害等［2～4］，在细胞内数个因素相互作用导致产生氧化应激的状态。酒精导致的肝脏损害主要由于脂质过氧化，蛋白的

8、羧基化，脂类自由基的产生，肝脏内抗氧化物质的降低［5～7］，尤其是还原型谷胱甘肽（reduce