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时间:2020-05-04
《大鼠法尼酯X受体慢病毒构建及鉴定-论文.pdf》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、第27卷第2期汕头大学医学院学报、,01.27No.22014JournalofShantouUniversityMedicalCoHege2014大鼠法尼酯X受体慢病毒构建及鉴定牛永东”,陈理明,昊曼鹏,程吉禾”,张艳美”,黄展勤”,石刚刚(汕头大学医学院l药理学教研室;2第一附属医院肿瘤科,广东汕头515041;3汕头市第二人民医院儿科,广东汕头515011)[摘要]目的:构建大鼠法尼酯x受体(rFXR)慢病毒,为研究FXR在原发性肝细胞癌中的分子机制奠定基础。方法:以DCMX-rFXR(NM021745.1)为模板,将rFXR克隆~UpWPXL表达载体中,酶切及DNA测序鉴定
2、后转染HEK293T细胞,包装重组慢病毒rFXRsh.RNA。Westernblot鉴定后,感染Huh7细胞进行功能检测。结果:证实pWPXL-rFXRsh-RNA构建及病毒包装成功;感染Huh7后,rFXR表达明显提高;FXR靶基因SHP和BSEP的表达增加。结论:pWPXL-rFXRsh-RNA慢病毒构建及包装成功,为研究FXR的生物学功能奠定基础。[关键词]法尼酯x受体;慢病毒;原发性肝细胞癌[中图分类号]R73.3[文献标识码]A[文章编号]1007-4716(2014)02—0081-03法尼酯x受体(FXR)是核受体超家族中的重要RNA抽提试剂Tfizo1(Invi廿o
3、gen公司,美国)、逆一员“。在肝、肾、肠等组织中高表达。功能与胆转录cDNA用TAKARA的ReverseTranscripdonSystem酸合成、代谢和转运调节有关。生理情况下,可保护Kit。Rea1.timePCR反应系统用ABI7300Rea1.time胆酸蓄积引起的肝毒性。研究发现,FXR与肝细胞PCRSystem的PCRMasterMix试剂盒。Cyclophilin上的增殖、炎症、再生等调控有关。近年来,FXR游引物:5’.TGGTGTTTGGCAAAGTGAAA-3’,下游:被认为可能是原发性肝细胞癌(HCC)发生的一保护5'-TCGAGTTGTCCACAGTCA
4、GC.3’;SHP上游引物:性因素”。本研究拟构建针对大鼠FXR的sh.RNA慢病5’.GAGCCTGCCTGAAAGG一3’,下游:5'-TCC.毒表达载体,包装sh.RNA病毒,为进一步研究PXRAGGAC1vrCACACAGCAC3’;BSEP上游引物:在HCC发生中的机制奠定基础。5'-GTTGCTGGAA1GGAAAGGA.3’,下游:5'-AGG.cAAAGCAGAATccGTAA.3’。所获取的基因相对定1材料与方法量数据(倍数)分析采用2。法。1.1材料1.4转染及慢病毒包装HEK293T细胞、人肝癌细胞Huh7(ATCc细胞库,1.0xl0个HEK293T接种6c
5、m培养皿,设Scramble美国)、表达质粒pWPXL、包装质粒psPAX2及对照组和pWPXL.rFXRsh.RNA组。转染前2h换无血pMD2.G(Addgeneplasmid12257,DidierTronolab)、清培养基,0.5pWPXL-rFXRsh-RNA质粒与1.5感受态BH101(上海市肿瘤研究所,中国)。胎牛血清混合包装载体质粒混匀于250OPTI.MEM无血清(FBS)、DMEM、OPTI。MEM培养基(Gibco公司,培养基中,l0LipofectamineT~2000共转染美国);T4DNA连接酶(Promega&~,美国);限制HEK293T,24h后
6、换DMEM完全培养液。鉴于性内切酶M/uI、XhoI(NEB公司,美国);阳离子脂pWPXL—sh.RNA自带GFP(绿色荧光),48h后镜下观质体LipofectamineTM2000、DL2000DNAMarker察,确定转染的慢病毒载体是否表达,72h收集上清(LifeScience公司。美国)。液,0.45岬滤膜过滤分装,.70℃备用。1.2重组子构建1.5Westernblot用iProofHFmasterMixPCR1(it进行PCR。rFXR收集Huh7,PBS洗涤3次,提取总蛋白,按《分基因特异引物(上游:5'-CCGCTCGAGatgaatctgattgg—收稿日
7、期:2014—03—26gccc-3’),下游:5'-CCGACGCGTtcactgcacatcccagatct一基金项目:广东省自然科学基金资助项目(S20l20l00lO955);3’)。1%(质量分数)琼脂糖凝胶电泳鉴定。QiageneGel中国博士后科学基金资助项目(2012M510200);广东省医学科研ExtractionKit回收PCR产物。Vectors或Inserts在50uL基金资助项目(A2013656);上海市肿瘤研究所“癌基因及相关基酶切体系
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