大鼠法尼酯X受体慢病毒构建及鉴定-论文.pdf

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1、第27卷第2期汕头大学医学院学报、，01．27No．22014JournalofShantouUniversityMedicalCoHege2014大鼠法尼酯X受体慢病毒构建及鉴定牛永东”，陈理明，昊曼鹏，程吉禾”，张艳美”，黄展勤”，石刚刚(汕头大学医学院l药理学教研室；2第一附属医院肿瘤科，广东汕头515041；3汕头市第二人民医院儿科，广东汕头515011)[摘要]目的：构建大鼠法尼酯x受体(rFXR)慢病毒，为研究FXR在原发性肝细胞癌中的分子机制奠定基础。方法：以DCMX-rFXR(NM021745．1)为模板，将rFXR克隆~UpWPXL表达载体中，酶切及DNA测序鉴定

2、后转染HEK293T细胞，包装重组慢病毒rFXRsh．RNA。Westernblot鉴定后，感染Huh7细胞进行功能检测。结果：证实pWPXL-rFXRsh-RNA构建及病毒包装成功；感染Huh7后，rFXR表达明显提高；FXR靶基因SHP和BSEP的表达增加。结论：pWPXL-rFXRsh-RNA慢病毒构建及包装成功，为研究FXR的生物学功能奠定基础。[关键词]法尼酯x受体；慢病毒；原发性肝细胞癌[中图分类号]R73．3[文献标识码]A[文章编号]1007-4716(2014)02—0081-03法尼酯x受体(FXR)是核受体超家族中的重要RNA抽提试剂Tfizo1(Invi廿o

3、gen公司，美国)、逆一员“。在肝、肾、肠等组织中高表达。功能与胆转录cDNA用TAKARA的ReverseTranscripdonSystem酸合成、代谢和转运调节有关。生理情况下，可保护Kit。Rea1．timePCR反应系统用ABI7300Rea1．time胆酸蓄积引起的肝毒性。研究发现，FXR与肝细胞PCRSystem的PCRMasterMix试剂盒。Cyclophilin上的增殖、炎症、再生等调控有关。近年来，FXR游引物：5’．TGGTGTTTGGCAAAGTGAAA-3’，下游：被认为可能是原发性肝细胞癌(HCC)发生的一保护5'-TCGAGTTGTCCACAGTCA

4、GC．3’；SHP上游引物：性因素”。本研究拟构建针对大鼠FXR的sh．RNA慢病5’．GAGCCTGCCTGAAAGG一3’，下游：5'-TCC．毒表达载体，包装sh．RNA病毒，为进一步研究PXRAGGAC1vrCACACAGCAC3’；BSEP上游引物：在HCC发生中的机制奠定基础。5'-GTTGCTGGAA1GGAAAGGA．3’，下游：5'-AGG．cAAAGCAGAATccGTAA．3’。所获取的基因相对定1材料与方法量数据(倍数)分析采用2。法。1．1材料1．4转染及慢病毒包装HEK293T细胞、人肝癌细胞Huh7(ATCc细胞库，1．0xl0个HEK293T接种6c

5、m培养皿，设Scramble美国)、表达质粒pWPXL、包装质粒psPAX2及对照组和pWPXL．rFXRsh．RNA组。转染前2h换无血pMD2．G(Addgeneplasmid12257，DidierTronolab)、清培养基，0．5pWPXL-rFXRsh-RNA质粒与1．5感受态BH101(上海市肿瘤研究所，中国)。胎牛血清混合包装载体质粒混匀于250OPTI．MEM无血清(FBS)、DMEM、OPTI。MEM培养基(Gibco公司，培养基中，l0LipofectamineT~2000共转染美国)；T4DNA连接酶(Promega&~，美国)；限制HEK293T，24h后

6、换DMEM完全培养液。鉴于性内切酶M／uI、XhoI(NEB公司，美国)；阳离子脂pWPXL—sh．RNA自带GFP(绿色荧光)，48h后镜下观质体LipofectamineTM2000、DL2000DNAMarker察，确定转染的慢病毒载体是否表达，72h收集上清(LifeScience公司。美国)。液，0．45岬滤膜过滤分装，．70℃备用。1．2重组子构建1．5Westernblot用iProofHFmasterMixPCR1(it进行PCR。rFXR收集Huh7，PBS洗涤3次，提取总蛋白，按《分基因特异引物(上游：5'-CCGCTCGAGatgaatctgattgg—收稿日

7、期：2014—03—26gccc-3’)，下游：5'-CCGACGCGTtcactgcacatcccagatct一基金项目：广东省自然科学基金资助项目(S20l20l00lO955)；3’)。1％(质量分数)琼脂糖凝胶电泳鉴定。QiageneGel中国博士后科学基金资助项目(2012M510200)；广东省医学科研ExtractionKit回收PCR产物。Vectors或Inserts在50uL基金资助项目(A2013656)；上海市肿瘤研究所“癌基因及相关基酶切体系