TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测甲型肝炎减毒活疫苗病毒含量的研究-论文.pdf

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1、·14·微生物学免疫学进展2013年lO月第41卷第5期ProginMicrobiolImmunol，Oct2013，Vo1．41No．5．U菩}．TaqMan实时荧光定量RT—PCR检测甲型肝炎减毒活疫苗病毒含量的研究夏青娟，徐晓霞，李树林，岳立广，龚士卿，刘令九(1．长春生物制品研究所有限责任公司，吉林长春130062；2．中国生物技术股份有限公司，北京100029)摘要：目的建立一种快速定量检测甲型肝炎减毒活疫苗病毒含量的实时荧光定量RT—PCR方法。方法对Gen—Bank中登陆的甲型肝炎减毒活疫苗株

2、(L—A一1)和其他甲型肝炎病毒基因组全序列比较分析，根据其高度保守的5端非编码区设计针对甲型肝炎减毒活疫苗株特异性引物与探针，对荧光定量RT—PCR反应条件进行优化，检测该方法的特异性和灵敏性，并对甲型肝炎减毒活疫苗病毒含量进行定量检测。结果该方法对甲型肝炎减毒活疫苗株高度特异，扩增片段为207bp，不与其他肠道病毒发生非特异性反应。在10CCID。／管～10～CCID。／管之间有良好的扩增曲线，检测的灵敏度可达0．1CCID。～0．01CCID。，比普通RT—PCR高100倍。结论该方法具有快速、灵敏、

3、特异、重复性好等优点，可应用于甲型肝炎减毒活疫苗生产过程中病毒含量滴度测定及指导疫苗成品的配制。关键词：甲肝病毒；实时荧光定量RT—PCR；TaqMan探针中图分类号：Q939．4文献标志码：A文章编号：1005—5673(2013)05—0014—04EstablishmentaTaqManreal--timeRT-·PCRindetectionofhepatitisAviruscontentinhepatitisA(1ive)vaccineXIAQing—juan，XUXiao—xia，LIShu—li

4、n，YUELi—guang，GONGShi—qing，LIULing-jiu(ChangchunInstituteofBiologicalProductsCo．Ltd，Changchun130062，China)Abstract：ObjectiveToestablishaspecificTaqMan—basedReal—timeRT—PCRassayfortherapiddetectionofhepatitisAviruscontentinhepatitisA(1ive)vaccine(HAV)．Metho

5、dsThegeneinattenuatedstrainofhepatitisA(L—A一1)con—tainedinHAVwasdown—loadedfromGenbankandalignedbyusingthebiologicsoftwaTe，andthespecificprimersandprobesweredesignedinthe5一NCRofL—A一1．Theprimersandprobesaswellasthereactionconditionwereoptimizedtoimprovethes

6、ensitivityandspecificityfortheassay．AndthenthismethodwasusedindetectionofRNAforhepatitisAvirusinHAV．ResultsA207bpfragmentwasspecificallyamplifiedfromL—A一1strain，butnotfromthetestedotherenterovir—uses．Ithadnocrossreactionwithalltheotherenteroviruses．Thesens

7、itivityofthisassaywas0．1CCID50．Theamplifica—tioncurvewasinalinearcorrelationinbetween10CCID5o／tube一10一CCID5o／tube．ConclusionTheTaqMan—basedreal—timeRT—PCRassayestablishedinthisstudywassensitiveandpreciseforthespecificandrapiddetectionofhepatitisAvirusconte

8、ntinHAV．ItwasappliedsuccessfullyinpreparationofthevaccineproductinprocessofHAVproduction．Keywords：HepatitisAvirus；Real—timereversetranscription—polymerasechainreaction(RT—PCR)；TaqManprobe甲型肝炎(甲肝)疫苗已被列入计划免疫，对甲