准确快速测定木瓜蛋白酶活性的方法研究.pdf

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1、轻工科技2012年l2月uGHTNDusTRYscENcEANDTEcHN0LoGY食品与生物第12期(总第169期)准确快速测定木瓜蛋白酶活性的方法研究黄春喜，廖春芳，黄宜辉，张增峰，丁年平(广州市微生物研究所，广东广州510663)【摘要】实验通过改变缓冲液的配方、测定样液的PH、温度、吸光谱波长等测定条件，研究木瓜蛋白酶的最佳的快速测定方法。实验证明木瓜蛋白酶在加有0．05％半胱氨酸盐酸盐的磷酸盐缓冲液的1：1甘油溶液中溶解性大，在pH=7．5，温度55~C，吸光度275nmJ~．，具有最大的吸收波长，同时试验结果具有良好的重现性。【关键词】木瓜蛋白酶；紫外光谱法；

2、酶活力【中图分类号】R155．5【文献识别码】A【文章编号]2095．3518(2012)12．05—021前言至100mL。木瓜蛋白酶(Papain)简称木瓜酶，又称为木瓜酵素。是利用L一酪氨酸标准贮备液(1OOu~mL)：准确称取预先于105℃未成熟的番木瓜(Caricapapaya)果实中的乳汁，采用现代生物工干燥至恒重的L．酪氨酸0．1000~00002g，用lmol／L盐酸60L溶解程技术提炼而成的纯天然生物酶制品。它是一种含疏基(．sH)肽后定容至lOOmL，即为lmg／mL酪氨酸溶液。链内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有较广泛的特异性，对动吸取lmg／mL酪

3、氨酸溶液10．OOmL，用0．1mol／L盐酸溶液定植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力，同时，还具有合容至lOOmL，即得到100ug／mL的lL．酪氨酸标准贮备液。成功能，能把蛋白水解物合成为类蛋白质，因此被广泛用于食2．2实验仪器品，化妆品，药品等行业中。作为一种水解性蛋白酶，测定其活分析天平(精密度为士0．0002g)、酸度计(精密度为士0．01PH性是研究酶的特性及使用的前提条件，也是评价酶品质的主要单位)、恒温水浴锅(精密度为4-0．2℃)、紫外分光光度计752型。条件。它的活性受多方面因素的影响，如溶酶介质、酶解温度、PH值、酶解时间等，使得难以准确测

4、定其活性，给市场监控酶活3分析步骤品质带来了一定的难度，同时可以更好地指导生产过程中酶活3．1制定标准曲线使用量的投入。用C=100ug／mLL．酪氨酸标准贮备液绘制一系列标准曲线，目前测定木瓜蛋白酶常用的方法有紫外吸收光谱法和福林计算吸光度为1时的吸光常数K值(K值应在130～135范围内，苯酚法。本文根据木瓜蛋白酶的特性，通过加入1：1甘油加大木否则应该重做)。瓜蛋白酶的溶解度，使用盐酸半胱氨酸一水合物激活酶的最大3．2待测酶液制备活性、研究测定样液PH、测定温度、最大吸收光谱等测定条件，采准确称取木瓜蛋白酶1—2g于研钵中，精确值士0．0002g，用用紫外吸收光谱法

5、，研究木瓜蛋白酶的最佳测定条件。本文的少量相应缓冲溶液溶解，并捣研，然后将上清液倾入容量瓶中，测定方法快速准确、简便、成本低，可广泛用于各种木瓜蛋白酶沉渣再用缓冲液溶解、捣研重复操作3～4次，最后全部移人容量的检测。瓶中，用缓冲液定容至刻线，摇匀，用四层纱布过滤，滤液根据酶活力用缓冲液进行适当的稀释，供测试用。2实验试剂与仪器3．3测定2．1实验试剂取4支试管(1支作为空白，3支作为样品)分别加入2．OOmL盐酸溶液：(C=lmol／L和C=0．1mol／L)按GB／T601配制。酶液置于55℃土O．2oC的水浴锅中预热5min，然后取出往空白管氢氧化钠溶液：(C=0．5

6、mol／L)按GB／T601配制。中加入4．00mL三氯乙酸，同时向3支样品管中各加入2．00mL酪缓冲液(PH=7．5)：十二水合磷酸氢二钠6．02g和二水合磷酸素，摇匀放回水浴锅中。10rain后，往空白管中加入2．OOmL酪素二氢钠0．5g、盐酸半胱氨酸一水合物O．05g，溶于800mL1：l的甘并向3支样品管中各加入4．OOmL三氯乙酸，摇匀并静止lOmin后油中，再用lmol／L的盐酸或者1mol／L的氢氧化钠调至PH=7．5，过滤，于275nm紫外分光光度计下测定，用10mm的比色皿，以空然后用1：1甘油定容至1L。白管作参比。三氯乙酸溶液(CC1·COOH)

7、=0．4mol／L：称取三氯乙酸3．4计算65．4g，用水溶解并定容至1000mL。X=AxKx8／2x1／10xnxE=2／5xAxKxnxE酪蛋白溶液(10．0g／L)：准确称取酪蛋白(NICPBP中国药品式中，x：样品的酶活力，u／g；A：试样溶液的平均吸光度；K：生物制品检定所，批号：140601．200723)1．0000~0．0002g，用少量吸光常数；8：反应总体积；2：吸取酶液2．00mL，以mL计；1／10：反氢氧化钠溶液湿润后，加入相应的缓冲溶液约80mL，在沸水浴应时间10min，以1min计；N：稀释倍