B7-H1启动子荧光素酶报告基因载体的构建及活性检测.pdf

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1、2014年7月基础医学与临床July2014第34卷第7期Basic&ClinicalMedicineVo1．34No．7文章编号：1001—6325(2014)07—0955．06研究~g-文B7一H1启动子荧光素酶报告基因载体的构建及活性检测吴胜昔，陈永文，朱广倍，费蕾，吴玉章(1．重庆理工大学药学与生物工程学院，重庆400054；2．第三军医大学基础部免疫学教研室，重庆400017)摘要：目的构建含B7．H1启动子的荧光素酶报告基因载体，转染肝癌HepG2细胞进行活性检测。方法PCR扩增B7-H1启动子上游区域基因片段，并插入到含有荧光素酶报告基

2、因的载体PGL3一Basic中构建重组子，经双酶切和测序鉴定后，将重组子转染HepG2细胞，用双荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶表达活性。结果成功地构建了6种不同长度的PGL3-B7一H1．Luc荧光素酶表达质粒，分别命名为P88、P175、P203、P398、P723和P960。瞬时转染HepG2后经报告基因检测，P175、P203、P398、P723和P960所含5段启动子均具有转录活性，IFN-作用后启动子活性明显增强，而P88转染组IFN一作用后，荧光素酶活性无显著变化。结论成功构建了B7一H1启动子的荧光素酶报告基因载体。关键词：B7H1

3、；启动子；双荧光素酶报告基因检测；活性测定中图分类号：R392文献标志码：AConstructionofluciferasereportergenevectorscontainingB7-H1promoterregionandpromoteractivityassayWUSheng—xi，CHENYong—wen，ZHUGuang—bei，FEILei，WUYu．zhang(1．SchoolofPharmacyandBioengineering，ChongqingUniversityofTechnology，Chongqing400054；2．Dept

4、．ofImmunology，theThirdMilitaryMedicalUniversity，Chongqing400017，China)Abstract：ObjectiveToconstructluciferasereportergenevectorscontainingB7一H1promoterregionandtodetectpromoteractivityinHepG2cells．MethodsFragmentsoftheB7一H1gene5-UTRpromoterswereamplifiedbyPCRandclonedintoPGL3bas

5、icvectorandnamedasP88，P175，P203，P398，P723，andP960respectively．ThenHepG2cells，weretransfectedwiththeseconstructedplasmids．TheexpressionofluciferasebeforeandaftertheadditionofIFN一^ywasdetectedbydual—lueiferase(LUC)reporterassaysystemkit．ResultsFiveluciferasere．portergenevectorscon

6、tainingB7一H1promoterregionweresuccessfullyconstructed．TherecombinantconstructsweretransientlytransfeetedintoHepG2cells．AftertheadditionofIFN一^y，LUCdetectionassayshowedthattheex—pressionofLUCwassignificantlyenhancedbyP175，P203，P398，P723orP960，butnotbyP88．ConclusionsLueiferaserepo

7、rtergenevectorscontainingB7-H1promoterregionweresuccessfullyconstructed，whichmaybeval—uableforfurtherstudyonB7一H1promoteractivityandmolecularmechanism．Keywords：B7-H1；promoter；dua1．1uciferaserepo~erassaysystem；activityassay收稿日期：2014—02—28修回日期：2014．04．17基金项目：重庆市基础与前沿研究计划(cstc2013j

8、cyjA10068)；重庆市教委科学技术研究项目(KJ130802)‘通信作者(corresp