乳腺癌MiR-34a启动子荧光素酶载体构建及活性测定.pdf

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1、第24卷第6期广东石油化工学院学报V01．24No．62014年12月JournalofGuangdongUniversityofPetrochemicalTechnologyDecember2Ol4乳腺癌MiR一34a启动子荧光素酶载体构建及活性测定伍泳彰，马超，刘杰凤，韩寒冰，程水明(广东石油化工学院生物工程系，广东茂名525000)摘要：提取人乳腺癌细胞(Mc丌)基因组DNA，应用PCR扩增miR一34a启动子序列，将其克隆连接到荧光素酶报告质粒pGL3一Basic中；瞬时转染人肾上皮细胞(293T)，检测荧光

2、素酶活性。成功构建了pGIJ3一miR34a—promoter报告基因载体并对其测序验证，结果表明启动子序列正确，载体具有较高的启动子活性。关键词：miR一34a；启动子；荧光素酶载体；转录活性中图分类号：Q78文献标识码：A文章编号：2095—2562(2014)06—0009—04MicroRNAs(miRNAs)是一类长约22个核苷酸内源性的非编码单链RNA分子，它本身不能编码蛋白质，进化上高度保守，广泛分布于病毒、植物和高等哺乳动物中。MiRNAs分子可以调节数百个靶基因，其功能涉及细胞生长、发育和凋亡等许多

3、复杂生命过程nI4]。在众多恶性肿瘤中，miRNAs的表达失调具有共同现象，它可导致正常细胞的恶性转化。目前已经发现的人类miRNAs大部分(52％)位于已知的肿瘤相关基因组区域内或已知的基因脆性位点【5引，如D53是细胞中重要的抑癌基因，大约50％人类肿瘤中都能够检测出抑癌基因p53的突变或缺失，而最新研究发现miR一34家族在被称作“基因组守护者”的p53调控通路中发挥着不可忽视的作用[1。miR一34a通过调控p53渠道，下调cdk4、cdk6、e2f3、e2f5、C—met等基因发挥其肿瘤抑制功能[1。此外，

4、miR一34a可能在癌症中由于启动子甲基化、基因缺失和p53基因突变失活而低表达n。但目前miR一34a的表达转录机制尚未明确，故研究miR一34a启动子在体外转录活性为进一步探索其作用机制有重要意义。本文通过构建人乳腺癌miR一34a启动子荧光素酶载体，转染293T细胞，进行体外转录活性分析检测，从人类基因组DNA中采用PCR法扩增出miR一34a的启动子序列，酶切后定向插入pGL3一basic载体，构建pGL3一miR34a—P荧光素酶真核表达载体，可为探讨miR一34a在乳腺癌中的表达转录调控机制奠定初步基础。

5、1材料与方法1．1实验材料PGL3一Basic载体、MCF7细胞(人乳腺癌细胞)、293T细胞(人肾上皮细胞)、E．coilDI-ISa感受态细胞均由广州赛哲生物科技有限公司实验室保存。基因组抽提试剂盒(GeneJ11TGenomicDNAPurificati0nKit)、质粒抽提试剂盒(GeneJETPlasmidMiniprepKit)、高保真扩增酶(Phushionenzymes)、胶回收试剂盒(GeneJETGelExtractionKit)、脂质体转染试剂(LipofectamineTM2000)、连接酶(

6、T4DNALigaseenzymes)、快速限制性内切酶(FastDigestBgl1、Nhe工)均为Thermo产品。1．2实验方法提取MCF7细胞(人乳腺癌细胞)基因组DNA，应用PCR扩增miR一34a启动子序列并将其连接于pGL3一收稿日期：2014—05—21；修回日期：2014—11—11作者简介：伍泳彰(1991一)，男，广东肇庆人，在读本科，主要研究方向为生物信息学及基因组测序技术等。通讯作者：马超(198O一)，男，安徽淮北人，博士，讲师，主要研究生物医学工程及医学生物信息学等。l0广东石油化工学院

7、学报2014年Basic荧光素酶报告基因上游多克隆位点上，通过测1429bp序鉴定，获得含miR一34a启动子荧光素酶载体，载l4Ilel■——一lⅡ∞i肿34&叽’锄l。ter体构建示意图详见图1。+1．2．1引物设计根据从“miRBaseSequenceDatabase”数据库中得到的miR一34a和Pre—miR34a序列，搜索人类基因组数据库(GenBank)，获得Pre—miR34a(Gene1D407040)，从转录起始位点上游一1429～0区域(长度1429bp)设计引物。应用PrimePremier5

8、．0软件设计miR一34a启动子扩增引物，并根据pGL3一Basic的图1miR～34a启动子荧光素酶载体构建流程酶切位点，在上游引物加NheI酶切位点，下游引物加BglⅡ酶切位点，并分别加入保护碱基CTA、GGA。引物均由广州吉格生物科技有限公司合成。miRNA34a启动子扩增引物如下：Pfi—miR34a—FP：5’一CTAGCTAoC=1