斑马鱼生长抑素转基因载体构建及启动子活性分析

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1、本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院(筹)可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：口不保密，昧密期限至年月止)。学位论文作者签名：酬＼生杉导师签名：转签字日期：例7年易月歹日签字日期：如‘／年易月罗日本论文由国家重大科学研究计划项目(973)：“调控内胚层组织器官发育的分子机制"(2009CB941200)资助3．2实

2、验方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯313．3P1一P5质粒在HepG2细胞中的活性检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一343．4实验结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯353．5．结果与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．4l结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯45参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯47致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

3、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．59攻读硕士学位期间发表论文及参与科研项目⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．61m√皿Jo以_J加“∞舶凹加●■●■●■●．¨．¨●■●■●■●■●■●■●■●■●■●■●■●缩写用下，EGFP绿色荧光在斑马鱼胚胎中呈现全身性表达；挑选了24hpf发荧光的胚胎对数据进行统计分析发现：乃忍mRNA与质粒共注射的斑马鱼胚胎中绿色荧光约占56．79％左右，而只注射重组质粒的胚胎这一效率有大约27．45％；只注射质粒的对照组胚胎EGFP的表达模式为嵌合型表达，而共注射组则更倾向于片状或带状表

4、达；3dpf时质粒对照组和共注射组荧光胚胎占分别占5．54％和34．08％，这说明共注射组表达更稳定。生长抑素4主要在内分泌胰脏以及胚胎早期发育过程中的底板中表达。借助于生物信息学软件分析斑马鱼ss4翻译起始位点上游2467bp的核苷酸序列中对其表达调控起作用的潜在顺式作用元件。我们发现在斑马鱼ss4可能参与肝胰脏发育、心血管形成等生命过程。我们克隆了这段区域并将其分为长度大小不等的五段分别亚克隆到pGL3．basicvector中，然后将其转染HepG2细胞，利用Promega双荧光报告检测试剂盒来检测不同启动子活性的强弱。以翻译起始位点A+lTG为

5、参照，我们发现翻译起始位点上游．2200bp左右处存在核心启动子，上游．1000bp至．2000bp范围内可能存在对其活性有抑制作用的元件，在上游．500bp处可能存在起促进作用的元件。关键词：生长抑素；斑马鱼；转座子；启动子活性分析两南大学硕上学位论文differentgenesalongwiththevarifiedsomatostatinreceptorsallowsomatostatintopossessalargerangeoffunctions．Thezebrafishsslisexpressedinboththecentralnervou

6、ssystemandthepancreas．BasedOiltheTo／2transposonfoundinmedaka，arecombinantplasmidWasconstructedbyGatewaytechnologywhichcontainsanubiquitouspromoter,ORFofssl，EGFPfluorescentreportergeneandalongterminalrepeatsrecognizedbYTo／2transponase．Weco-injectedtheplasmid(100ng／ui)andinvitrotr

7、anscriptedTo／2mRNA(100ng／u1)ataratioof1；1intotheplasmaofone-twocellstagesembryosandthecontrastWasonlyinjectedplasmaid(50ng／u1)andanalysethetransientexpressionpaaem．WefoundthatCMV／SP6ubiquitiouspromoterCanproduceembryoswithEGFPsystemicexpression．24hourpostfertilizationembryoswere

8、pickedupandusedtoanalyzethetransgenicefficiency