转基因斑马鱼构建与果蝇幼虫荧光基因的瞬时表达打印版

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1、转基因斑马鱼构建与果蝇幼虫荧光基因的瞬时表达蒋驭天(生命科学学院2008级生物技术2008300113)同组人：王诗婕吕晓霞刘楚怡一.摘要：本实验对斑马鱼和果蝇幼虫分别导入含EGFP和DFP的质粒，观察其在2中动物体内的表达情况，在斑马鱼体内，绿色荧光蛋白从原肠胚到出苗期均能在荧光显微镜下观察的绿色荧光；在果蝇幼虫体内，才3-4小时时也能观察到红色荧光蛋白基因的瞬时表达。关键字：转基因斑马鱼果蝇幼虫二.实验器材与试剂：仪器：试管、试管架、可调式微量加样器、电泳仪、电泳槽、染色缸；42℃恒温水浴箱、冰浴、恒温振荡箱，超净工作台

2、、手动显微注射器、体式显微镜，硼硅酸玻璃毛细管、倒置显微镜、摄像系统（CCD）、自动水循环系统一套，孵化水槽、培养皿、解剖镜、小规模质粒提取试剂盒。试剂：EGFP绿色荧光蛋白基因DFP红色荧光蛋白基因pEGFP-N2载体Ecoli三.实验步骤：转基因斑马鱼构建：1.转染细菌的培养（1）培养基的制备：称取胰蛋白胨3g，酵母提取物1.5g，NaCl3g，于一500mL的三角瓶中，加入蒸馏水至300mL溶解.若配制固体培养基，则需加入4.5g琼脂(1.5%)，然后用NaOH调pH至7.5。分装于3个250mL的三角瓶中，加塞，包扎

3、。（2）培养基的灭菌与消毒:在灭菌锅中，加入适当的水，放入已包扎好的培养基，盖好盖子，加热。当压力升至0.05MPa时，打开放汽阀，排除冷空气，当压力回到0时，关闭放汽阀，当压力升至1.034MPa时保持15-30分钟后，停止加热，压力降为0时，打开放汽阀排汽取物。（3）含Amp的LB固体培养基:将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右，加入Amp（氨苄青霉素）储存液,使终浓度为50μg/mL,摇匀后铺板。（4）接种加甘油保存的分别含质粒的Ecoli.，每管接种体积为10微升（5）37℃摇床过夜培养24h.2.质粒的

4、小量提取提取步骤：（1）.样本处理：收集已培养12～16小时的菌液13ml，12000rpm离心1分钟，尽量吸除上清。注：菌液较多时可以通过多次重复离心将菌体收集到1个离心管中。菌液收集量由菌浓而定，收集菌体过多会反而降低裂解效果。（2）.悬浮：向菌体沉淀的离心管中加入250ul溶液Ⅰ，用移液器反复吹打或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。（3）.裂解：加入250ul溶液Ⅱ于细菌悬液中，温和地上下颠倒6～8次，使菌体充分裂解，加1管混合1管，确保溶液充分、及时的混匀。充分裂解后的菌液会变得相对粘稠；为防止DNA断裂，避免剧烈混匀

5、操作及裂解时间过长。（4）.中和：加入350ul溶液Ⅲ,立即温和上下颠倒6～8次，充分混匀，加1管混合1管。此时会出现白色絮状沉淀，静置2分钟，12000rpm离心5分钟（可适当延长至10min）。注：溶液Ⅲ加入后应立即混匀，避免产生局部沉淀。若上清液中仍存在微小白色沉淀，可重复离心后取上清。（5）.吸附：小心地将上清液转移至吸附柱中，12000rpm离心30～60秒，弃收集管中废液，然后将吸附柱重新套入废液收集管中。若上清一次加不完，可重复操作（转移时不可吸入沉淀，此步很重要）。（6）.漂洗：向吸附柱中加入600ul漂洗液

6、PW（使用前请检查是否已加入无水乙醇），12000rpm离心30～60秒。（7）.重复步骤6，弃收集管中废液。（8）.将吸附柱套于收集管中，10000rpm离心2分钟。注：此步骤绝对不可省略，目的是去除吸附柱中残余的漂洗液，因为漂洗液中乙醇的残留会影响后续实验（酶切，PCR等）。（9）.洗脱：将吸附柱置于一干净的1.5ml离心管中，向吸附柱膜中央部位悬空滴加50～100ul溶解液TE或灭菌双蒸水（pH值在7.0-8.5），室温静置2～10分钟，12000rpm离心2分钟，即得提取质粒DNA，-20℃保存。3.将提取出的质粒双

7、酶切，将其线性化并导入荧光蛋白基因，经1.0%琼脂糖凝胶电泳，得到一大小为6.0kb的带，将起切下纯化并回收。4.采用光周期诱导方法得到斑马鱼受精卵5.受精后第一次卵裂前进行基因注射，每次注射的DNA溶液约1-2nL。转基因受精卵置于Holtfreter’s于室温培养，适时更换培养液，待胚胎发育至原肠期后，将培养液逐渐用暴气的冷开水稀释，发育至心跳期以后，将胚胎转移到暴气的冷开水中培育。6.在480nm激发光照射的荧光倒置显微镜下观察EGFP在转基因斑马鱼胚胎中的表达。果蝇幼虫荧光基因的瞬时表达1.琼脂板的配置，用1.5%的

8、琼脂配成培养基，倒在垫滤纸培养皿的盖子上。2.将培养的果蝇放飞，留下培养皿的幼虫。3.在解剖镜下，将果蝇培养基里的幼虫按照1龄、2龄、3龄用镊子挑到刚才倒好的3个琼脂培养皿上。4将3个分好类的果蝇幼虫的培养皿拿到显微注射仪下，分别在每只幼虫体内注入一定量的含DFP的DNA。共注射5组，每组