斑马鱼血红素加氧酶1的低氧保护作用及转基因鱼研究.docx

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1、斑马鱼血红素加氧酶1的低氧保护作用及转基因鱼研究血红素加氧酶1(HO1)是血红素降解的起始酶和限速酶,具有抗氧化、抗炎、抗凋亡等作用,可被氧化应激、紫外照射、重金属等多种因素诱导表达。在前期工作中,我们发现鲫鱼和斑马鱼Ho1基因均为低氧应答基因。在此基础上,本论文首先利用离体实验模型斑马鱼胚胎成纤维细胞(ZF4)进一步研究了鱼类Ho1的低氧保护作用,然后对ho1转基因斑马鱼进行了初步研究。取得的主要结果如下:用低氧(1%O2)处理ZF4细胞24h、48h和72h,然后利用Real-TimePCR检测ho1mRNA的表达水平。结果显示,低氧可显著诱导ho1基因的转录,ho1mRNA的高水平表

2、达一直持续到低氧处理后72h。结果表明,在ZF4细胞低氧适应的过程中Ho1可能发挥重要的作用。用不同浓度的锌原卟啉(ZnPPⅨ,0、5、10、15、20μM)抑制低氧条件下ZF4细胞Ho1的表达,利用CCK8试剂盒测定ZF4的细胞活力。结果显示,ZnPPⅨ处理可显著降低低氧条件下ZF4细胞的生存活力,并且这种作用具有浓度依赖性,ZnPPⅨ浓度越高,降低作用越强。ZnPPⅨ的抑制作用可以被一定浓度的HO1诱导剂血红素(Hemin)回复。随后,我们选取10μMZnPPⅨ进行下一步实验。将ZF4细胞随机分成4组,常氧组、低氧组、ZnPPⅨ+低氧组、ZnPPⅨ+Hemin+低氧组。常氧组给予10μ

3、MDMSO,在常氧下进行实验;后三组分别给予10μMDMSO、10μMZnPPⅨ、10μMZnPPⅨ和10μMHemin,低氧处理48h,然后利用显微镜观察各组的细胞形态。结果发现,低氧组仅有少数细胞死亡,ZnPPⅨ+低氧组出现大面积细胞死亡,而ZnPPⅨ+Hemin+低氧组较ZnPPⅨ+低氧组细胞死亡率显著减少。上述结果表明,低氧条件下诱导Ho1的表达可显著提高细胞活力。用ZnPPⅨ抑制低氧条件下ZF4细胞Ho1的表达,利用Hochest染色、Caspase3活性检测和DNALadder等方法检测细胞的凋亡情况。结果发现,常氧组无明显细胞凋亡,低氧组仅发生少数细胞凋亡,抑制低氧条件下Ho

4、1的表达后细胞凋亡率显著上升,而Ho1的诱导剂可在一定程度降低低氧条件下由于Ho1表达降低增加的细胞凋亡率。上述结果表明提取斑马鱼基因组列,并将其连接到,低氧条件下Ho1的过表达可显著降低低氧诱导的细胞凋亡。DNA,利用PCR技术扩增斑马鱼ho1(Drho1)1675bp的启动子序pBK-Tol2载体上,构建重组质粒pDrho1-Pro-GFP。克隆鲫鱼ho1(Caho1)795bp的ORF序列及斑马鱼hsp701543bp的启动子序列,以一定的顺序连接到经改造的pT2AL200R载体中,构建重组载体pCaho1-hsp-GFP。将两种重组质粒分别显微注射斑马鱼胚胎,然后置于荧光显微镜下

5、观察胚胎发育过程中荧光蛋白的表达情况。结果发现绿色荧光蛋白均成功表达,表明pDrhol-Pro-GFP和pCaho1-hsp-GFP质粒具有较好驱动GFP表达的能力。在此基础上,将两种重组质粒与转座酶mRNA混匀后分别显微注射斑马鱼胚胎,筛选并培育有绿色荧光的胚胎。在转pDrhol-Pro-GFP的斑马鱼培养至3个月时,提取其尾鳍DNA,利用PCR扩增技术共筛选到两尾F0代阳性鱼。转pCahol-hsp-GFP质粒的斑马鱼目前还在培育中。两种转基因斑马鱼的构建将为活体条件下研究鱼类Ho1在低氧适应中的表达特征和功能奠定基础。