斑马鱼干扰素抑制isknv感染的作用及斑马鱼il413作用的研究

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1、中山大学博士学位论文斑马鱼干扰素抑制ISKNV感染的作用及斑马鱼IL4/13作用的研究姓名：李中圣申请学位级别：博士专业：水生生物学指导教师：何建国20100607斑马鱼干扰素抑制ISKNV感染的作用及斑马鱼IL4／13作用的研究专业：水生生物学博士生g李中圣指导老师：何建国教授中文摘要传染性脾肾坏死病毒(ISⅪW)是细胞肿大虹彩病毒属的代表种，它是引起我国养殖鳜大量死亡的传染性疾病的一种DNA病毒。在文章的第一部分，本论文以斑马鱼ISKNV感染模型研究了重组斑马鱼干扰素(z仔IFNl)对ISKNV引发的急性感染的抑制作用。这是在鱼类中首次

2、分析干扰素对DNA病毒抑制作用研究，也是对鱼类干扰素在活体中抗病毒研究的补充。为了得到足量的干扰扰素，我们首先利用果蝇胚胎细胞表达系统(DrosophilaExpressionSystem)筛选出稳定表达重组斑马鱼干扰素的细胞系，诱导表达的含zI暗IFNI的上清经纯化后，干扰素的活性在斑马鱼细胞虎纹蛙病毒(TFV)的感染模型中得到验证——重组干扰素可以有效抑$4TFV感染及上调Mx；E因表达。重组干扰素体内抗病毒的实验结果表明：腹腔注射zfrIFNl可以在24d'时内上调IFN刺激的基因如Mx、STATIa，STAT-lb，STAT-2，I

3、RF2、皿F7、IRF9、rig-1，刷眩和MHC-1等；与对照组相比，这些宿主基因的表达在ISKNV感染3d后迅速降低，然而病毒基因MCP和VP48的转录在感染3d后仍然被抑制。为了评估zfrIFNl对ISKNV的保护效率，我们分析了不同时间点腹腔注射zfrIFNl对ISKNV导致的斑马鱼死亡的抑制作用，ISKNV感染前0，6，24h，注射剂量为lgg／缒重的z衔FNl可以有效降低斑马鱼相对死亡率(1冲s)；然而在ISKNV感染24tJ、时后，等剂量的z疔IFNl不能提供有效的保护。据此，我们推测干扰素在抗ISKNV感染中起重要作用，外源

4、干扰素对病毒感染的抑制作用取决于病毒感染的进程。HI摘要IFN对病毒的抑制作用是典型的细胞免疫，在鱼类中，目前尚无直接的证据表明鱼类有介导体液免疫的细胞因子，如IL．4。在文章的第二部分，我们基于已报道的研究成果，利用5’RACE技术获得了斑马鱼皿4／13B的全长eDNA序列，结合斑马鱼_．1L4／13．4序列，使用生物信息学的方法分析了斑马鱼两种类尼．4-Po驰L．13基因(zflL4／13A和zflL4／13B)编码氨基酸的结构特征和系统进化等；利用3’RACE技术证实斑马鱼IL．4受体(尼．锻)基因存在两种剪切方式：膜受体(儿．4砌彳

5、)和可溶受体(儿．4RS)。利用免疫共沉淀技术，分析了zfIIA／13A和znL4／13B与IL-4RS的相互作用，为了鉴定zflL4／13A和zfIL4／13B两种蛋白的功能，我们同时分析了他们同IL．13Ral和IL．13R0【2的相互作用，结果显示，zflL4／13A和zflL4／13B均可以和IL-4RS或IL．13Ral发生免疫共沉淀，二者都不能与IL．13Ro．2发生作用。为了进一步区．@zflL4／13A和zflL4／13B的功能，通过实时定量PCR检测了两者对IL．4激活基因(．洲巧和心Ⅳ)的激活作用和对IFN_l,的抑制作

6、用，重组zflL4／13A和zflL4／13B均可上调STAT6和MHCll表达，但znL4／13B的作用更为有效，zflL4／13A对皿4／13B有激活作用。据此，我们推测，斑马鱼zflL4／13A和zflL4／13B在结构和功能上没有类似高等动物1L．4与儿．J3的区分，两者功能相似并且存在相互协调的机制。本文对斑马鱼IFN抗ISKNV的功能研究和IL4／13的基凶鉴定和功能探索有助于人们对鱼类细胞免疫和体液免疫的认识，也有助于对免疫进化的认识和鱼类疾病的控制。关键词：斑马鱼，传染性脾肾坏死病毒，干扰素，白介素4或13，白介素4或13受

7、体，Th2细胞免疫。IVAdministrationofrecombinantIFNIprotectszebrafish(Daniorerio)fromISKNVinfectionandtheidentificationofzebrafishIL4／13ntlllCatlOnerallS1Major：HydrobiologyAuthor：LiZhongshengSupervisor：Prof．HeJianguoAbstractIridoviridaeisafamilyoflargedouble·strandedDNAvirus．Theyca

8、usesubclinicaltolethalinfectionsininvertebratesandpoikilothermicvertebrates．Asanimportant