荧光素酶报告基因载体

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1、为了适应公司新战略的发展，保障停车场安保新项目的正常、顺利开展，特制定安保从业人员的业务技能及个人素质的培训计划荧光素酶报告基因载体　　双荧光素酶报告基因实验的一些影响因素及注意事项　　转载请注明来自丁香园发布日期：XX-03-2613:43文章　　分享到：收藏夹新浪微博腾讯微博开心网豆瓣社区人人网　　关键词：双荧光素酶报告基因载体点击次数：24521．报告基因检测受多种因素影响，因此同批次样品检测值也可能出现浮动。所以实验一般需要做3个或3个以上复孔，并且引入另一个报告基因作为内参。　　2．细胞培养时间不宜过长，12-36h内最好；长时间培养后，细胞难裂解。　　3．双荧光素酶报告基

2、因的载体选择：　　a)萤火虫荧光素酶建议选取pGL-3或pGL-4的载体或自己构建相应的载体；　　b)海肾荧光素酶建议选取phRL-TK或pGL-4代载体或自己构建相应的载体。建议海肾载体不使用强启动子，而选用中等强度的启动子。　　4．双荧光素酶报告基因的载体比例：根据实验具体情况调整。建议作一个预实验来调整，萤火虫荧光素酶检测发光值大于海肾荧光素酶发光值的比例较好。　　5．最适反应温度：室温。各个组分都需要调整到室温。目的-通过该培训员工可对保安行业有初步了解，并感受到安保行业的发展的巨大潜力，可提升其的专业水平，并确保其在这个行业的安全感。为了适应公司新战略的发展，保障停车场安保

3、新项目的正常、顺利开展，特制定安保从业人员的业务技能及个人素质的培训计划　　6．双荧光素酶反应体积：20ul-100ul-100ul，底物量可根据实际情况调整，但一定要保证底物过量，不然会造成检测结果出现大的偏差　　7．细胞裂解产物存放：常温不超过6小时；-20℃一个月；-80℃半年　　8．裂解产物与底物混合：要求混合快速、混合时间一致，避免荧光素酶衰变的影响。　　9．发光半衰期：　　a)单荧光素酶检测试剂盒，萤火虫荧光素酶的发光半衰期约12min　　b)双荧光素酶检测试剂盒，萤火虫荧光素酶的发光半衰期约9min，海肾荧光素酶的发光半衰期约2min　　10．检测结果　　检测前应检测孔

4、板或空管的发光值，作为仪器发光背景值，Modulus多功能检测仪的仪器背景值应小于100；　　样品检测发光值应该远大于仪器背景值，例如10000。如果样品发光值过于接近仪器背景值，说明样品中荧光素酶过少，需要考虑转染量、转染效率、裂解效率等因素。　　报告基因载体目的-通过该培训员工可对保安行业有初步了解，并感受到安保行业的发展的巨大潜力，可提升其的专业水平，并确保其在这个行业的安全感。为了适应公司新战略的发展，保障停车场安保新项目的正常、顺利开展，特制定安保从业人员的业务技能及个人素质的培训计划　　(1)尽管可以从报告基因载体除去已知的结合位点，减少报告基因上游的转录，但从几千kb的

5、DNA中去除所有潜在的调控序列是不可能的。因此在使用报告基因载体时，应使用合适的对照载体。报告基因质粒载体一般在大肠杆菌中繁殖，因此包括一个DNA复制起始点(ori)和基因筛选标记，通常为氨苄西林抗性基因(Ampr)。另外还具有丝状噬菌体复制起始点(flori)，可使载体形成单链DNA，便于基因突变和测序。　　(2)报告基因和侧翼区：报告基因编码区和侧翼区常被改变。例如，去除SEAP羧基末端24个氨基酸，使SEAP能直接分泌到细胞外，因此测定SEAP活性不必裂解细胞。去除荧光素酶的过氧化物酶体靶向序列，使荧光素酶转运到细胞质而非过氧化物酶体中。为了使报告基因表达最大化，核糖体最佳结合

6、序列(GCCGCCCCATG)被置于报告基因的5’端。此序列能增加翻译效率，产生NcoI酶切位点，可使外源基因N末端与报告基因融合。　　(3)用于插入假定的克隆启动子或增强子／启动子区；另一个位于其他位置，用于插入克隆调控元件，例如插入可远距离发挥作用的增强子。另外，还有用于插入基因筛选标记的克隆位点，用于筛选稳定表达报告基因的宿主细胞。MGS具有几个单酶切位点，用限制性内切酶催化可产生黏性末端。DNA片段可插到此位点。MCS还包括一个或两个MCS末端，此末端序列可由限制性内切酶催化断裂形成3’悬垂末端，可用核酸外切酶Ⅲ进行嵌套缺失分析。目的-通过该培训员工可对保安行业有初步了解，并

7、感受到安保行业的发展的巨大潜力，可提升其的专业水平，并确保其在这个行业的安全感。为了适应公司新战略的发展，保障停车场安保新项目的正常、顺利开展，特制定安保从业人员的业务技能及个人素质的培训计划　　多聚腺苷酸(polyA)可增强哺乳细胞mRNA稳定性和mRNA的翻译。polyA序列紧随报告基因之后，可指导RNA转录物3’端添加200～250个腺苷酸残基。在转录单位5’端插入polyA信号能降低源于载体的隐匿启动子序列基因表达水平，去除背景表达，增加报告基因系