id1启动子的荧光素酶报告基因载体的构建及其在肝癌hepg2细胞中的活性检测论文

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1、Id1启动子的荧光素酶报告基因载体的构建及其在肝癌HepG2细胞中的活性检测论文丁睿，韩霜，雷婷，刘杰，窦科峰【摘要】目的：扩增Id1启动子基因，构建Id1启动子的报告基因载体.方法：通过PCR及双酶切方法，从HepG2细胞基因组DNA中获得Id1基因编码序列上游包含不同长度碱基的两段Id1启动子序列；分别克隆到报告基因pGL3enhancer载体上，构建包含两段不同长度Id1启动子的报告基因载体；用脂质体转染法将两报告基因载体分别转染至肝癌HepG2细胞系；采用双荧光素酶报告基因系统评估Id1启动子活性.结果：经PCR方法扩增出大小分别为1096bp和26

2、6bp的两段不同长度的Id1启动子片段.freelega公司）；LipofectaminTMReagent和T4DNA连接酶（Invitrogen公司）；细胞基因组DNA提取试剂盒（Ugene公司）；高保真TaqDNA聚合酶（上海生物工程公司）；PlasmidMiniprepKit和GelExtrationKit（Omega公司）；DNAmarker:GeneRulerTM100bpDNAladderPlus和GeneRulerTM1KbDNAladder（MBI公司）；胰蛋白胨及酵母提取物（宝泰克公司）；限制性内切酶HindⅢ，KpnⅠ（大连宝生物工程公司

3、）；其余试剂均为国产分析纯.TD20/20荧光照度计（TurnerBioSystems公司）；HepG2细胞和E.coli.JM109菌株均为本实验室保存.1.2方法1.2.1Id1启动子报告基因载体的构建1.2.1.1引物设计自dbtss.hgc.jp网站数据库检索获得Id1（GenBank/EMBL提取号码：NM002165）启动子序列的-3000～+100部分序列，分别设计两段启动子引物序列，并在上游引物5′端加入KpnⅠ的酶切位点GGTACC，在下游引物5′端加入HindⅢ的酶切位点AAGCTT.从转录起始零点开始，两段启动子片段长度分别为:－10

4、19～＋76（1096bp）和－189～＋76(266bp).上游引物分别为FL/L胎牛血清(FBS)的RPMI1640培养基在37℃，50mL/LCO2的孵箱中培养.收集对数生长期细胞约1×107，以细胞基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA.1.2.1.3启动子基因的克隆以HepG2细胞基因组DNA为模板，用Fin，55℃退火1min，72℃延伸1min,共30个循环，获得一长度为1096bp的片段，命名为Id1p1；选用Fg/L）的固体LB培养皿上，12h后挑取单克隆菌落，以质粒小量提取试剂盒提取质粒.行KpnⅠ和HindⅢ双酶切并测序鉴定阳性克隆的重组

5、质粒.最终构建成重组报告基因载体Id1p1/PGL3和Id1p2/PGL3.1.2.2Id1启动子载体转染肝癌HepG2细胞系将两种重组质粒、空载体pGL3enhancer和内参照pRLTK载体转化的阳性菌株，在LB培养基中37℃摇床培养过夜，按质粒提取说明分别提取Id1p1/pGL3，Id1p2/pGL3、空载体pGL3enhancer和pRLTK的DNA，经紫外分光光度仪测定A260nm值.按照LipofectaminTMReagent脂质体转染系统说明，于转染前1日将细胞接种于24空板，5×104/孔，第2日当细胞约90%融合时，每孔分别定量加入

6、Id1p1/pGL3(或Id1p2/pGL3)1.0μg，PRLTK内参照载体100ng，LipofectaminTM5μL和无血清培养基200μL.6h后换含FBS100mL/L的RPMI1640，培养18h.1.2.3报告基因活性的检测瞬时转染24h后收集、裂解细胞，离心取上清，用DualLuciferaseReporterAssaySystem在TD20/20荧光照度计上测定裂解上清内Luc(FireflyLuc和RenillaLuc)活性,计算FireflyLuc/RenillaLuc的比值，并以空载体pGL3enhancer转染细胞作对照，进行

7、比较以判断Id1p1和Id1p2启动子活性.2结果2.1目的基因的克隆及测序以肝癌细胞HepG2基因组DNA为模板，分别克隆出两段Id1启动子，分别为1096bp的Id1p1和266bp的Id1p2（图1）.图1PCR产物琼脂糖凝胶电泳略2.2启动子报告基因载体酶切及测序鉴定回收经KpnⅠ和HindⅢ双酶切得到的Id1p1和Id1p2两重组质粒和pGL3enhancer载体的相应条带，经T4连接酶连接后转化E.coli.JM109感受态细菌.再经KpnⅠ和HindⅢ酶切后，两种重组质粒分别释放出1096bp和266bp大小的片段（图2）.测序结果亦证实两段均

8、包含Id1启动子序列.表明包含不同长短