人原代晶状体上皮细胞中pedf基因下调对波形蛋白和αb晶状体蛋白含量的影响

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1、中山大学博士学位论文人原代晶状体上皮细胞中PEDF基因下调对波形蛋白和αB-晶状体蛋白含量的影响姓名：杨静申请学位级别：博士专业：眼科学指导教师：刘奕志20100520培养皿http://www.huayu-glass.com/中山大学博士论文人原代晶状体上皮细胞中PEDF基因下调对波形蛋白和QB-晶状体蛋白含量的影响人原代晶状体上皮细胞中PEDF基因下调对波形蛋白和ttB一晶状体蛋白含量的影响专业：眼科学博士生：杨静导师：刘奕志教授中文摘要研究目的：研究人原代晶状体上皮细胞中PEDF基因表达与

2、波形蛋白和aB一晶状体蛋白的关系。材料和方法：眼组织来源：人尸体眼球来源于中山眼科中心眼库。所有与尸体解剖相关性的研究均己通过中山大学人文伦理委员会的许可。我们所有的研究均遵照政府及相关公共组织的关于人类及动物实验伦理道德条款。人晶状体原代上皮细胞的培养：晶状体上皮细胞贴敷于尸体眼的晶状体前囊膜下。在解剖显微镜下，撕取晶状体的前囊膜，平铺于培养皿底部，上皮细胞面向上。滴取一滴胎牛血清与上皮细胞面，保持细胞面的湿润。放于37℃0．5％C02的培养箱孵育2小时，使前囊膜充分贴敷于培养皿的底部。用含2

3、0％胎牛血清的DMEM培养液于培养箱中进行培养。采用GenScript’ssiRNAdesigncentersiRNATargetFinder和siRNAConstructBuilder软件设计三个shRNA序列，用于人PEDF基因的RNA干扰。运用标准的分子生物学技术将这些寡核苷酸序列克隆到质粒载体SDl21l上。然后通过Gateway技术将设计的寡核苷酸序列克隆到pLenti6／V5．D．TOPO质粒载体中，用于慢病毒的产生。在用慢病毒感染细胞48小时后，用RNeasyplusMinikit

4、培养皿http://www.huayu-glass.com/中山大学博士论文人原代晶状体上皮细胞中PEOF基因下调对波形蛋白和Q8-晶状体蛋白含量的影响提取细胞中的总RNA。做三次重复的实时定量多聚酶链式反应(Real-timePCR)。实验中我们采用家族管理基因GAPDH作为对照基因。用AACt得出不同组PEDF基因RNA水平含量的差别。人原代晶状体上皮细胞PEDF基因RNA干扰48小时后，WesternBlot方法检测其中波形蛋白以及aB．晶状体球蛋白表达水平的变化。结果：人晶状体原代上皮细

5、胞的培养：带有晶状体上皮细胞的人晶状体前囊膜完整的贴敷于培养皿上，24小时观察到健康的晶状体上皮细胞贴敷于前囊膜上，5天后晶状体上皮细胞溢出囊膜范围，迁移到培养皿上。10天后，培养皿上上皮细胞达到70％-80％的融合，并且呈现出正常的上皮源性细胞的形态特征。慢病毒感染人原代晶状体上皮细胞：鉴于普通质粒转染技术在原代上皮细胞上的成功率比较低，所以我们构建了慢病毒载体结构来表达shRNA，以达到对PEDF基因下调的目的。同时我们在构建的shRNA结构中表达绿色荧光(GFP)片断，以便于观察感染的效率

6、。在荧光显微镜下，对感染48小时后的细胞照相，我们发现每一组的感染率都在8096左右。shRNA作用下PEDF基因被下调的效果鉴定表达相应shRNA的慢病毒感染人晶状体原代上皮细胞48小时后，收集细胞，提取RNA。用定量聚合酶链式反应(Real-timePCR)检测PEDF基因mRNA水平的表达变化。最终发现，未经任何慢病毒感染的对照组，以及表达非特异性随机序列shRNA(scramblegroup)的慢病毒组PEDF的mRNA在大致相同的表达水平。其余的三种针对于PEDF基因进行特异性RNA干

7、扰的慢病毒组，其PEDF的RNA水平与对照组以及scramble组比较均有显著的下调(p

8、试验组增加’93％．波形蛋白的表达量在shRNA-scramble试验组组中降低约’13％n培养皿http://www.huayu-glass.com/中山大学博士论文人原代晶状体上皮细胞中PEOF基因下调对波形蛋白和aB-晶状体蛋白含量的影响在shRNA-1试验组中明显降低约’72％，shRNA-2试验组中降低’7996，在shRNA一3试验组中降低~93％．这项试验结果显示在特异性针对PEDF基因进行RNA干扰的试验组(shRNA2，shRNA3和shRNA4)，波形蛋白的表达量明显降低，而