多顺反子质粒重编程人脂肪干细胞为诱导多能干细胞-论文.pdf

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1、I’●=PII]I!一、)lnⅣ、v．pibb．ac．cn多顺反子质粒重编程人脂肪干细胞为诱导多能干细胞术曲鑫建刘天庆宋克东李香琴葛丹关水(大连理工大学干细胞与组织工程研发中心，大连I16024)摘要为建立多顺反子质粒载体转染技术获得人脂肪干细胞(adiposestemcells，ASCs)来源的诱导多能干细胞(inducedpluripotencystemcells，iPSCs)，应用2A元件连接Oct4／Sox2／KLF4／c—Myc四因子基因，构建为单一开放阅读框的多顺反子质粒载体．使用该质粒对A

2、SCs进行转染及重编程为iPSC．采用形态学观察、特异性抗体免疫荧光鉴定、体外拟胚体诱导分化和体内畸胎瘤形成等方法进行鉴定．结果显示，ASCs成功重编程为iPSCs，具有与人胚胎干细胞相似的形态学及多向分化潜能；通过拟胚体和畸胎瘤实验证实iPSCs能在体内外分化成三胚层细胞；DNA印迹实验显示质粒载体序列未整合至iPSCs基因组中．因此，通过多顺反子质粒载体重编程技术成功建立的人iPSCs具有多向分化潜能，可减免发生插入突变和免疫排斥问题，为iPSCs在遗传性或退行性疾病的治疗奠定了实验基础．关键词多顺

3、反子质粒载体，诱导多能干细胞，人脂肪干细胞学科分类号Q813．5，Q291DOI：10．3724／SP．J．1206．2012．00454诱导多能干细胞(iPSCs)是指通过在分化的体染细胞的方式上，非整合转基因的瞬时转染方法为细胞中表达特定的转录因子来诱导其重编程而获得当前所寻求的重编程途径之一．的可不断自我更新和具有多向分化潜能的细胞．即重编程效率与所选择的细胞类型、使用转录因将4个外源转录因子基因Oct4、Sox2、K1f4和子种类和数量以及转基因方法密切相关．虽然小鼠c．Myc(或者Nanog和

4、Lin28)导入分化的体细胞，与人的成纤维细胞转入Oct4和Sox2两个基因即可可获得iPSCs．该细胞具有形成体内所有类型细胞重编程为iPSCts，但与转入4个外源因子比较，的特性，使其在细胞替代治疗、基因治疗和发育生重编程效率大为降低．此外，使用人体肝脏细胞和物学研究领域有着广阔的研究及应用前景．更为重神经前体细胞重编程为iPSCs已有报道n]，但此要的是，针对特定病人自身和特定疾病重编程产生类细胞不通过损伤性手术很难获得，况且一些细胞的iPSCs对再生医学、医药的发展以及特殊疾病机种类(如神经干细

5、胞)比较稀缺，不能大量采集，在理的认知都具有重要的意义[卜3J．临床上不能有效地作为候选细胞．随着iPSCs领域快速的研究进展，已经建立了人体脂肪干细胞(adiposestemcells，ASCs)是不同的细胞重编程方案，包括使用反转录病毒载含有多种前体细胞的异质群体，很容易通过吸脂手体、四因子的多顺反子慢病毒载体【4_和可外切的转术获得大量的细胞，这些细胞具有多向分化潜能，座子等方法[5．由于反转录／慢病毒载体及其携带的转基因序列可随机地整合进宿主细胞基因组中，会导致细胞具有很高的致瘤性．而可外切的转

6、座子国家自然科学基金(31170945)~n中央高校基本科研业务费专项资金(DUT11SM04)资助项目．方法(如Cre／LoxP重组法)虽可将整合在基因组上的+通讯联系人．转基因序列移除，但部分载体序列仍存留在宿主细Tel：0411-84706360，E—mail：liutq@dlut．edu．cn胞基因组上，也存在着安全性的问题．因此，在转收稿日期：2012—09．14，接受日期：2012—11-20曲鑫建．等：多顺反子质粒重编程人脂肪干细胞为诱导多能干细胞·437·可以向脂肪细胞、成骨细胞、软骨细

7、胞和心肌细胞胎牛血清DMEM重悬细胞，移入培养瓶中，进行分化[1~15]．脂肪干细胞具有不同的遗传和表观37。C、5％CO，培养箱孵育，每2～3天换液．细胞遗传表达谱，是一种比终末分化细胞更为理想的重达到100％融合时，用0．25％胰酶和0．04％EDTA编程细胞来源．在无细胞饲养层条件下，已有两个(1：1)消化传代．脂肪组织标本由大连医科大学第研究小组应用Yamanaka四因子分别采用反转录病二附属医院提供，患者对实验知情同意，并经医院毒载体和慢病毒载体将脂肪干细胞重编程为伦理委员会批准．iPSCs．

8、与重编程成纤维细胞过程相比，时程缩短1．3质粒转染ASCs且效率得到提高．但由于使用的是病毒载体，同样转染前1天，将处于对数生长期的细胞用存在着安全性的问题[1&17]．0．25％胰酶消化，制成单细胞悬液后接种于6孔板本研究采取成年人脂肪干细胞为种子细胞，采内，每孔接种细胞数为1．5x10s．第2天待细胞生用2A元件连接Oct4／Sox2／Klf4／c．Myc四因子构建长汇合80％时开始转染，按磷酸钙法操作．转染而成的多顺反子质粒载体(pI