耐吉非替尼人非小细胞肺癌细胞株的建立及其耐药机制-论文.pdf

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1、·160·安徽医科大学学报ActaUniversitatisMedicinalisAnhui2014Feb；49(2)耐吉非替尼人非小细胞肺癌细胞株的建立及其耐药机制吴敏，袁媛，潘跃银。，张颖摘要目的建立人非小细胞肺癌吉非替尼(Gefitinib)耐NSCLC患者，在治疗1年后仍不可避免的出现获得药的细胞株PC9／Gefitinib，并研究其可能的耐药机制。方法性耐药，最终导致肿瘤复发。该研究使用对ce．采用体外浓度梯度递增的诱导方法建立Gefitinib获得性fitinib高度敏感的肺腺癌细胞株PC9，通过体

2、外诱导耐药细胞株PC9／Gefitinib；M1rr法计算出PC9和PC9／Ge—对Gefitinib产生获得性耐药，建立PC9／Gefitinib耐fitinib的半数抑制浓度(IC。)和耐药指数(RI)及PC9／Ge—药细胞株，并研究其可能耐药机制。fitinib细胞对多西他赛、培美曲塞及吉西他滨的敏感性；流式细胞仪检测其细胞周期分布；Westernblot法检测p-AKT和1材料与方法Bcl-2蛋白的表达。结果建立了对Gefitinib耐药的PC9／1．1实验材料DMEM培养液和胎牛血清购自美Gefiti

3、nib细胞株，其RI是亲代PC9的106．95倍，且PC9／Ge—fitinib细胞株对化疗药物多西他赛的敏感性增加，而对培美国Hyclone公司；二甲基亚砜(DMSO)、碘化丙啶曲塞表现出轻度耐药。耐药前后2种细胞株的G。／G期、S(PI)和MTY购自美国Sigma公司；p-AKT、AKT抗期差异有统计学意义(P<0．05)，G：／M期差异无统计学意体购自美国CST公司；Bcl一2、B-actin抗体购于北京义。与PC9细胞相比，PC9／Gefitinib中Bcl-2蛋白表达升高，中杉金桥生物技术有限公司；免

4、疫印迹化学发光试而p-AKT表达水平下降。结论成功建立一株耐Gefitinib剂ECL购自美国Millipore公司；人NSCLCPC9细胞的人非小细胞肺癌细胞株PC9／Gefitinib，推测其耐药机制与株由广东省医学科学院(广东省肺癌研究所)惠赠；Bcl一2蛋白表达升高及p-AKT表达下降有关。Gefitinib由英国阿斯利康公司惠赠；盐酸吉西他滨关键词吉非替尼；非小细胞肺癌；耐药由美国礼来公司惠赠；多西他赛购自江苏恒瑞医药中图分类号R734．2有限公司；培美曲塞购自齐鲁制药有限公司。文献标志码A文章编号1

5、000—1492(2014)02—0160—041．2方法1．2．1细胞培养PC9细胞培养于含10％胎牛血肺癌是全球癌症相关性死亡的主要原因，其中清、100U／ml青霉素、100txg／ml链霉素的DMEM非小细胞肺癌(non．smallcelllungcancer，NSCLC)培养液，培养于37oC、5％CO，的恒温培养箱中，倒是肺癌中最常见的类型，占所有肺癌的80％～85％¨J置显微镜下观察细胞形态及生长状态，每1—2d传。化疗作为晚期NSCLC的主要治疗手段，其代一次，取对数生长期细胞进行实验。疗效已达到

6、了平台期，很难进一步提高患者的生存1．2．2耐药细胞株PC9／Gefi6nib的建立采用体率。。随着肺癌分子靶向治疗的深入研究，以表外逐步递增浓度方法诱导。取对数生长期的PC9皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor，细胞加入含Gefitinib的培养液，Gefitinib从低浓度EGFR)为靶点的小分子酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine10nmolJL(1／2IC。浓度)开始，作用24h，敏感细胞kinaseinhibitor，TKI)吉非替尼(Gefitinib)在含有逐渐

7、死亡，弃去培养液，用PBS缓冲液洗3遍，换新EGFR突变的晚期NSCLC患者的I临床治疗中疗效鲜培养液，耐药细胞在不含药物的培养液中继续培显著。然而，即使对Gefitinib初始治疗敏感的养至对数期，逐渐提高Gefitinib的浓度，如此反复诱2013—08—06接收导，换液传代，直至该细胞株能够在1．0I．zmol／LGe-基金项目：安徽高校省级自然科学研究项目(编号：KJ2012A157)fitinib浓度下稳定生长。历时6个月，最终得到耐作者单位：‘安徽医科大学第三附属医院干部病房，合肥230061受Ge

8、fitinib1．0~zmol／L的细胞株。合肥市滨湖医院中心实验室，合肥2306011．2．3MTT法检测PC9／Gefitinib耐药指数(resist-安徽医科大学第一附属医院肿瘤科，合肥230022anceindex，RI)及药物敏感性取对数生长期的细作者简介：吴敏，女，硕士研究生；胞，用胰酶消化，制成单细胞悬液，并调整细胞浓度潘跃银，男，教授，主任医师，硕士生导师，责任作者，