大鼠血管平滑肌细胞的原代培养及鉴定-论文.pdf

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1、2014年3月第3期鞫游刚嘲蘼大鼠血管平滑肌细胞的原代培养及鉴定曾羽熊伟(贵州遵义医学院贵州遵义563003)【摘要】目的：探讨大鼠胸主动脉平滑肌细胞原代培养的方法，观察其生长特性，为相关研究提供实验材料。方法：组织块贴壁法培养大鼠血管平滑肌细胞，胰酶消化法进行传代，倒置显微镜观察细胞生长特点，用平滑肌细胞的3种标记分子(SMA、SM22、Calponin)免疫细胞化学法鉴定细胞的纯度，掌握细胞的冻存与复苏。结果：织块接种于培养瓶内4—6天即可见数个细胞以垂直方向从组织块边缘游出，培养至2周游出细胞逐渐向组织块周围生长形成细胞晕，进而形成细胞簇，镜下可见细

2、胞呈典型的“蜂”“谷”样生长，免疫细胞化学显示平滑肌细胞的3种标记分子均为阳性表达。结论：组织块贴壁法简便、经济，培养的平滑肌细胞数量多、生长状态良好，为研究心血管疾病提供良好的体外模型。【关键词】大鼠-血管平滑肌细胞；原代培养；冻存；复苏【中圈分类号】R329【文献标识码IA【文章编号]1oo5一oo19(2Ol4)03—0045一Ol血管平滑肌细胞(VSMC)的异常增殖是许多心血管疾病的共同病理基础，在高原代培养时，组织块接种于培养瓶内第4—6天即可见有数个细胞以垂直方向血压、动脉粥样硬化和血管成形术后再狭窄等许多血管性疾病中，都涉及到血管平从组织块边

3、缘游出，游出细胞渐向外生长形成细胞晕，进而形成细胞簇，14天左右滑肌细胞的异常增殖[1]。血管由3个部分组成，自内向外依次是内膜层、中膜层和即可见细胞呈典型的“峰谷”样生长，光镜观察细胞形态多样，呈梭形、星形或不规则外膜层，内膜层主要由血管内皮细胞和少量的平滑肌细胞组成．外膜层由成纤维细形，大小略有差异，胞体较小，胞质折光性强}传代后VSMC突起增多。胞质伸展，较胞组成，中膜层由血管平滑肌细胞组成，平滑肌细胞主要收缩调节机体的血流和血多分枝状突起，细胞周界不清、透明度增高，折光性下降。VSMC胞核多为卵圆形，压，其功能障碍在心血管疾病中起着非常重要的作用，

4、因此，对血管平滑肌细胞的生有一个或多个核仁；胞浆丰富，有时有暗色颗粒，少数细胞有双核或三核。有时有暗物学特性进行深入研究，才能探明上述血管疾病的发病机制。在VSMC的研究中，色颗粒，细胞间常有突起相连。传代血管平滑肌细胞：光镜下观察呈现特征性“峰”、组织块贴壁法培养VSMC和胶原酶消化法是目前采用的非常广泛的技术。本实验“谷”状生长。电镜下观察：细胞形态不规则，胞浆内有肌丝，纵向平行排列。有密区，采用组织块贴壁法进行大鼠胸主动脉平滑肌细胞的培养，并采用平滑肌细胞的3种具备平滑肌细胞特征。免疫组织化学染色后平滑肌细胞的3种标记分子(SMA、标记分子(SMAS

5、M22Calponin)进行免疫细胞化学鉴定。SM22、Calponin)呈阳性表达，可见细胞胞浆中大量平行条状棕黄染色、胞核不着色。1材料与方法证明所培养的细胞都是平滑肌细胞，纯度达98以上。血管平滑肌细胞在冻存复1．1材料。动物来源t健康Wistar大鼠，由第三军大学实验动物中心提供。雌苏后任能旺盛生长。雄不限，体重180～200g。DMEM高糖培养基(美国Gibco公司)，Hepes(索莱3讨论宝)，优质胎牛血清(原代培养浓度20，传代培养浓度1o，美国Hyclone)，胰蛋血管平滑肌细胞异常增殖和迁移是所有损伤性血管疾病的共同病理生理学改白酶，鼠单

6、抗肌动蛋白sMA、SM22、Calponin(北京博奥森生物)，DAB显色试剂盒，变，由其造成的动脉粥样硬化形成、血管损伤后狭窄严重制约了这些疾病的远期疗通用型免疫组化检测试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)其余试剂均为国产效，威协患者的生命安全[5]。因此．研究防治VSMC异常增殖在细胞和分子生物分析纯。学中的变化成为血管生物学领域研究的热点[6，7l。体外大鼠胸主动脉平滑肌细胞1．2方法的培养为寻找新的防治方法提供了理想的实验模型。目前常用的培养方法有两种，1．2．1取材：断颈法处死Wistar大鼠，消毒胸腹部，大组织剪、组织镊剪开胸组织块贴壁法和酶

7、消化法(胰酶和胶原酶)，采用组织块培养法虽然成功率高，方法腹部皮肤，更换器械，切开胸腹部，并切除部分胸壁以利于暴露胸主动脉，用眼科弯操作简便、经济，培养的平滑肌细胞数量多、生长状态良好，但耗时长，会影响了实验镊和眼科剪分离胸腹主动脉并放入盛有无菌PBS的细胞培养皿中。转入超净工作进度，在需要大量细胞做实验的时候这种方法具有明显的缺陷。用酶消化法简化了台上，眼科直镊和弯镊清除结缔组织和血块，剥除动脉外膜。放人另一盛有PBS的实验操作和缩短了培养细胞的时间，在较短时间内即可获得大量细胞，但步骤繁琐，细胞培养皿中．减去血管外的细小分支，并放入含10胎牛血清的DM

8、EM中。眼科容易造成污染，需要大量的组织块，且酶作用的时间不宜控制