顺铂对人肺腺癌细胞作用与ERCC1、Bcl-2表达的相关性研究.pdf

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1、·764·中国临床药理学与治疗学◇基础研究◇中国药理学会主办CN34—1206／R，ISSN1009—2501http：／／www．cjcpt．com2013Jul；18(7)：764—768顺铂对人肺腺癌细胞作用与ERCC1、Bcl一2表达的相关性研究金艺凤，何贝，刘东华，王莹皖南医学院附属弋矶山医院呼吸内科，芜湖241001，安徽；安庆市立医院呼吸内科，安庆246000，安徽摘要目的：探讨ERCC1、Bcl-2表达与顺铂作用中图分类号：R965．2的关系，进而推测ERCC1、Bcl一2在顺铂耐药中的文献标识码：A作用。方法：选择人肺腺癌细胞A

2、549及其耐文章编号：1009-2501(2013)07—0764—05DDP细胞株A549／DDP作为研究对象，采用MTT法检测A549／DDP细胞耐药指数；免疫细随着肺癌发病率的逐年增加，对于肺癌化疗胞化学方法、RT—PCR方法检测不同浓度、不同作药物与耐药相关基因的研究已成为近年的热点。用时间干预后细胞中ERCC1、Bcl一2的表达。结以铂类药物为基础的化疗方案是治疗非小细胞肺果：10t~g／mLDDP作用12h，A549细胞中ER—癌的主要药物。有研究表明，核苷酸交叉修复互CC1、Bcl一2mRNA表达开始增高，随着作用时间补基因1(Ex

3、cisionrepaircross—complementing的延长，ERCC1、Bcl-2mRNA的表达逐渐增高，genel，ERCC1)、Bcl一2与肿瘤耐药相关。本研究在72h表达最强。浓度为5~tg／mL的DDP即通过体外培养人肺腺癌细胞A549，通过不同浓度可刺激A549细胞中ERCC1、Bcl一2mRNA表达DDP干预、DDP干预不同时间后ERCC1、Bcl一2水平上升，随着DDP浓度的增加，其表达水平逐mRNA表达的变化，及细胞免疫化学方法检测渐上升，ERCC1民mRNA表达水平在ERCC1、Bcl一2蛋白表达的变化，探讨ERCC1

4、、20／~g／mL组达到高峰。与亲本细胞相比，A549／Bcl一2与顺铂的关系。DDP中ERCC1、Bcl一2表达明显增高。结论：随1材料与方法着顺铂作用时间的延长和浓度的增加，A549细胞中ERCC1、Bcl一2mRNA和蛋白的表达量增加，1．1主要材料与仪器人肺腺癌细胞株A549、推测ERCC1、Bcl一2可能参与了顺铂继发耐药的A549／DDP购自南京凯基生物公司；注射用顺铂形成。为山东齐鲁制药厂产品(20rag／支)；Trizol试剂关键词肺癌；顺铂；耐药；ERCC1；Bcl一2盒、逆转录试剂盒、Taq酶，鼠抗人ERCC1抗体、Bcl一2

5、抗体(购自santcruz公司)；全自动酶标仪；PTC一150型热循环仪(美国MJ公司)；杭州四季2O13一O3—21收稿2013-06—07修回青胎牛血清。安徽省高等学校省级科学研究项目(KJ2011B195)1．2引物设计与合成ERCC1、Bcl-2及内参照金艺凤，女，硕士，副主任医师，硕士研究生导师，研究方向：肺部肿瘤的诊断与治疗。Ei-actin引物由上海生工生物工程有限公司合成。Tel：0553—5739338E-mail：Jingyf0415@yeah．netERCC1上游引物序列为5，-GGCAGTTCAG—王莹，通信作者，女，本科

6、，主任医师，副教授，硕士研究生导师，研GCTCTAGTGG一3，下游引物序列为5，-究方向：肺部肿瘤的诊断与治疗。Tel：0553—5739338E-mail：w19y29h@163．cornCAGCTCCCAAAAAGAAGACG一3，扩增片段大中国临床药理学与治疗学2013Jul；18(7)·765·小为271bp；Bcl一2上游引物序列为5'-GGATGC—成cDNA，具体操作按RT—PCR试剂盒说明书进CTTTGTGGAACTGT一3，下游引物序列为5，_行。逆转录总反应体系为20L。反应在PTC-AGCCTGCAGCTTTGTTTCAT

7、一3，扩增片段大150型热循环仪上进行，94℃3min蛋白变性小为256bp；内参照I3一actin上游引物序列为5，一后，加入Taq酶，进入热循环。ERCC1反应条件CTTCTACAATGAGCTGCGTG一3，下游引物序为：94。C变性30S；51℃退火30S；72℃延伸歹Ⅱ为5，-TCATGAGGTAGTCAGTCAGG一3，扩45S，共33个循环，最后72℃延伸5min。Bcl一增片段大小为305bp。反应在PTC一150型热循2反应条件为：94℃变性30S，45。C退火30S；环仪上进行。72℃延伸45S，共33个循环，最后72℃延伸1

8、．3MTT法检测A549／DDP对DDP的耐药指5min。J3一actin反应条件为：94℃变性30S；数收集对数生长期细胞，制成单细胞