浓香型白酒窖泥中细菌多样性的免培养技术分析.pdf

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1、浓香型白酒窖泥中细菌多样性的免培养技术分析汤斌，刘金英，周庆武，李安军，万春环，汤有宏1(安徽工程大学微生物发酵安徽省工程技术研究中心，安徽芜湖，241000)2(安徽古井贡酒股份有限公司，安徽毫州，236826)摘要采用免培养(cultureindependent)技术直接从浓香型白酒窖泥中提取细菌微生物混合基因组DNA(也叫元基因组DNA)，利用细菌16SrDNA通用引物扩增窖泥细菌的序列，根据16SrDNA序列对细菌多样性进行初步分析。采用PCR扩增技术、分子克隆技术以及序列同源性分析等方法测定细菌的16SrDNA，通过与基因数据库中相似菌群序列同源性的比较，得到样品菌种多样性，分别

2、构建系统发育树。结果显示，细菌含有几大类群，表现出高度的细菌多样性。共分为Unculturedbacterium、Clostridium、Lactobacillus、Eubacterium和Syntroph—omonas五个细菌分类。关键词浓香型白酒，窖泥，微生物多样性，免培养法，系统发育树近年来分子生物学技术不断兴起，研究者可以选泥。用更先进的分子技术手段分析样品的各种信息资源。(2)菌种：DH5aEscherichiacoli，安徽工程大学可16SrDNA分类方法被大家广泛采用，将免培养分析再生资源研究室保藏。法与其结合，能准确快速的分析样品中微生物构成的(3)主要试剂和仪器：TaqD

3、NA聚合酶、PCR产多样性¨j。物纯化试剂盒，上海生工；连接酶及相关试剂，Takara中国浓香型白酒的生产以泥窖的窖池为基础，发公司；DNA大片段回收试剂盒(Biotech)，抗生素氨苄酵的过程就是栖息在窖泥和糟醅的庞大而复杂的微青霉素，上海生工；PCR引物合成，上海生工；英国生物相互之间做用的结果。由于我国研究专家在固Techne公司的TC-312型PCR仪；高速冷冻离心机，态发酵窖池上具有得天独厚的地理优势，在窖泥的微贝克曼公司；XSJ-HS型显微摄影仪，上海华宇。生物生态，特别是在主要功能菌的分离培养，人工培1．2实验方法育活性窖泥等方面取得了很大的成绩。但仅仅依托1．2．1总DNA

4、的提取于传统的微生物分离培养的分析方法是远远不能满从土壤样品中高效提取可进行分子操作的基因足窖泥微生物生态学研究的需要。众多研究表明自组DNA是进行免培养法的基础。此过程包括：从环然界微生态系统中可培养的微生物仅仅占微生物总境样品中高效获得粗制基因组DNA和去除粗制数的0．1％一10％。本研究运用免培法初步探索DNA中的杂质。了白酒窖池窖底窖泥中细菌的多样性构成，通过窖泥直接提取窖泥微生物总DNA的方法采用预处理细菌菌群16SrDNA序列同源性和系统发育远近关和不进行预处理的提取方法有明显区别：未预处理的系初步了解了窖泥中含有哪些微生物，初步了解细菌提取方法得到的DNA样品电泳条带有明显的

5、弥散的组成框架，希望对窖泥的传统培养法提供一点指导现象，而经过预处理得到的DNA样品的条带较整意义齐。这是因为对窖泥进行预处理可以有效地去除杂质，减少胞外游离DNA污染，减少可溶性的无机物、1材料与方法有机物和腐植酸类物质的污染。特别是腐殖酸影响1．1实验材料后续PCR的质量所以在参考大量的文献后本研(1)分析样品：安徽古井贡酒酒厂窖池底层窖究采用如下方法：取适量的窖泥冷冻干燥过夜；取200mg加入2mLEP管中；采用0．1mol／LpH7．6磷第一作者：学士，教授。酸盐缓冲溶液(NaC10．8％，KC10．02％，Na，HPO项目基金：安徽省自然科学基金(No．KJ2007A018)。收

6、稿日期：2012—02—28，改回日期：2012—04—270．15％，KH2PO40．025％)1mL浸泡5min；1000r／min离心2min，去上清液；重复步骤2依次；加入2012年第38卷第7期(总第295期FOODANDFERMENTAT10NINDUSFRIES们无疑代表了新的分类单元，如果能深入研究这些序和差异性，一方面浓香型白酒呈香成份主要为己酸乙列的宿主菌对深入探索窖泥细菌多样性更具有深远酯所以主要的菌种类群基本相似，另一方面由于各酿的意义。酒厂土质、地理环境的差异以及窖泥时间长短等因素对于整个细菌域来说，除了未培养菌株外，梭状的不同；再者免培养研究法本身所具有的不可避

7、免的芽孢菌为窖泥的优势菌，并没有呈现多种类的多样方法缺点所以肯定存在差异性。性。这可能由于窖泥底层，土壤结构、营养成分、理化3讨论性质、土壤环境很稳定，一些适应此环境的微生物就形成较优势的菌群生存，不适应这个环境的微生物就本文利用免培养法对安徽古井贡酒酒厂窖池窖逐渐被淘汰。Clostridium类群能降解有机底物产生底的窖泥进行细菌微生物多样性的研究，来确定窖泥醇类、有机酸、CO／H：以及矿物质成分，一般从厌氧中优势细菌