三疣梭子蟹养殖塘免培养细菌多样性分析【文献综述】

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1、毕业论文文献综述生物工程三疣梭子蟹养殖塘免培养细菌多样性分析摘要：三疣梭子蟹（Portunustrituberculatus）是我国海产经济蟹类，近年来浙江省沿海的三疣梭子蟹养殖业发展非常迅速，但是病害发生频繁，成为其稳产、高产的主要限制瓶颈。由于养殖水体中微生物的多样性特别是异养细菌的菌群结构及其演替规律对于探明梭子蟹发病原因及制定病害防治措施具有重要意义。关键词：三疣梭子蟹；海水养殖塘；微生物群落；弧菌1三疣梭子蟹简介1.1养殖情况三疣梭子蟹（Portunustrituberculatus），俗称梭

2、子蟹、白蟹，属于甲壳纲、十足目、9梭之间，最适子蟹科，是中国沿海的重要经济蟹类。梭子蟹一般在3-5米深海底生活及繁殖，冬天移居到10-30米的深海，喜在泥沙底部穴居。其适应盐度为16‰-35‰，水温在4℃-34℃，PH值在7-9盐度为26‰-32‰之间，最适温度在22℃-28℃。水质要求清新、高溶氧，当环境不适应或脱壳不遂时有自切步足现象，步足切断后能再生[1]。1.2营养价值三疣梭子蟹产量高，体大肉多，味鲜美，营养丰富，尤其是卵巢和肝脏。卵巢可供作上等调味品。肉除鲜食外,还可制作罐头,畅销国内外。壳可

3、作药材用，又可提取甲壳质，广泛用于多种工业。1.3养殖存在的问题病害的发生是梭子蟹、病源菌和环境相互作用的结果，其中环境中的理化因子变化可改变养殖水体及底泥中微生物的群落结构，当管理不当，水质恶化，再遇上天气的急剧变化（急剧降温、暴风雨侵袭、连续阴雨天等）时，有益有害微生物之间的平衡被打破，条件致病菌大量繁殖，导致梭子蟹疾病的发生，因此研究养殖水体中微生物的多样性特别是异养细菌的群落结构及其演替规律对于探明梭子蟹发病原因及制定病害防治措施具有重要意义[2-5]。1.4养殖塘水质调节养殖管理正常的养殖管理

4、同养虾基本相似，但还要根据蟹的不同习性，采取相应的不同管理措施。添换水前期添水，至水位升高后换水，根据水质情况调节换水量，高温季节高潮时尽量换水，日换水量１／３～１／５。进入９月交尾期后，要保持最高水位，并增加换水[6]。养殖塘菌种菌落对养殖塘水质则起到了自然调节的作用，对于减少三疣梭子蟹养殖过程中疾病发病率等方面起主要作用[7-12].2分子生物学方法在微生物生态上的应用受技术的限制，目前自然界中的绝大部分微生物人们还无法对其进行纯培养（见表1.1）。1982年，人们提出了“不可培养（活）微生物”（v

5、iablebutnonculturablemicroorganisms，VBNCMicroorgani-sms）的概念（徐怀恕等，1982），即指利用迄今所采用的分离培养方法还未获得纯培养的微生物。由于不可培养微生物不论其类群，还是其新陈代谢途径、生理生化反应、产物等都存在着新颖性和多样性，因而比以往的可培养微生物具有更为丰富多样的可供人们开发利用的生物资源。表1.1几个环境样品中可培养细菌的比率Tab.1.1Percentageofcultivatedbacteriainsomeenvironment

6、alsamples环境样品可培养率（％）海水（Seawater）0.01～0.10淡水（Freshwater）0.25湖水（Mesotrophiclake）0.1～1.0无污染的河口水样（Unpollutedestuarinewaters）0.1～3.0活性污泥（Activatedsludge）1～15沉淀物（Sediment）0.25土壤（Soil）0.3注：可培养的细菌是以菌落生成单位（CFU）来计算的（引自Amannetal，1995）目前应用最多的是以PCR技术为基础的研究方法，这些研究方法的最

7、初步骤都是通过PCR反应扩增目标序列，可操作性强，并且可以根据不同的分类水平（菌株、种、属等）使用不同的引物。2.1变性梯度凝胶电泳（DenaturingGradientGelElectrophoresis，DGGE）1993年Muyzer首次证实变性梯度凝胶电泳（DGGE）技术在揭示自然界微生物区系的遗传多样性和种群差异方面具有独特的优越性。近年来，该方法已被广泛地应用于各种环境微生态的研究中，主要是对微生物多样性进行定性或半定量的评估。DGGE的原理是：大小相同但碱基序列不同的DNA片段在含有变性剂

8、的凝胶中电泳时，由于其解链时需要不同的变性剂浓度，所以会在各自相应的变性剂浓度下变性，从而滞留于凝胶的不同位置。通过DGGE图谱，可以判断环境微生物群落中优势类群或独特种群的遗传多样性。某些情况下，为了得到更详细的信息，可以通过DGGE指纹与特定的寡核苷酸探针杂交或对切下的DGGE条带序列分析来进一步鉴定菌落成员[13-14]。2.216SrDNA文库构建目前，构建16SrDNA克隆文库是微生物分子生态学中用来调查环境中原核微生物组成的常用