三疣梭子蟹养殖塘免培养细菌多样性分析【开题报告】

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1、毕业论文开题报告生物工程三疣梭子蟹养殖塘免培养细菌多样性分析一、选题的背景与意义海水养殖塘是一种人工生态系统，微生物特别是细菌对这种生态系统的稳定和平衡起着很关键的作用，对养殖动物健康、生长也有着非常重要的影响。在这个生态系统中，细菌群落组成处于一种相对稳定的状态，此时，有益菌和有害菌(包括一些潜在的致病菌）共同存在于环境中，二者的相互制约使得养殖动物处在一个相对稳定的环境中，但一旦微生物群落组成发生了变化，将会导致其生态功能多样性发生较大改变，因此而产生的一系列后果，包括水质的恶化和病害的爆发等，都可能会严重影响水产动物的生长、

2、健康。因此，对养殖环境中的细菌群落组成及其变化进行研究分析是非常有必要的。越来越多的证据表明，由于受到现有条件和技术的限制，目前人们还无法纯培养自然界中绝大部分的微生物，1982年，人们提出了“不可培养(活）微生物”的概念(徐怀恕等，1982），由于不可培养微生物的物种类群及新陈代谢途径、生理生化反应、产物等都存在着丰富的多样性和新颖性，因而比起以往的可培养微生物就具有更加多样和丰富的可以供给人类进行开发和利用的生物资源。本研究从三疣梭子蟹养殖塘水样中直接提取细菌总DNA，然后通过构建16SrDNA克隆文库的方法来分析水体中微生物

3、的群落结构差异性，从而更为全面的了解不同养殖阶段养殖水体中微生物的群落组成及变化。三疣梭子蟹（Portunustrituberculatus），俗称梭子蟹、白蟹，属于甲壳纲、十足目、梭子蟹科，是中国沿海的重要经济蟹类。其生长迅速，养殖利润丰厚，已经成为中国沿海地区重要的养殖品种。三疣梭子蟹的渔汛一年有春秋两次，渔期长，产量高，体大肉多，味鲜美，营养丰富，尤其是卵巢和肝脏。卵巢可供作上等调味品。肉除鲜食外,还可制作罐头,畅销国内外。壳可作药材用，又可提取甲壳质，广泛用于多种工业。黄海和东海年产量各有1～2万吨上下。为中国最重要的海产

4、蟹，经济意义重大。近似种南海和东海还有远海梭子蟹(P.pelagicus)和红星梭子蟹(P.san-guinolentus)，在南海为常见经济种[1]。随着梭子蟹养殖业的快速发展，养殖规模不断扩大，养殖密度不断提高，梭子蟹的病害日益严重，并成为制约其健康发展的重要因素。能否有效控制疾病的发生和流行，关系到梭子蟹产业化养殖的健康、持续发展[2-4]。国内外许多学者对海洋细菌的生态分布、对虾养成期间水体和虾体中的异养细菌进行了大量的研究．但对梭子蟹养殖环境及生物体内的细菌学研究至今很少报道。国外的主要有KMuroga,KSszuik,

5、KIshimaru[5]对三疣梭子蟹弧菌larviculture，国内主要是张恒庆等对于三疣梭子蟹水体细菌多样性的研究[6]和张德民等对三疣梭子蟹养殖塘底泥进行DGGE分析细菌多样性[7]。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题：研究的基本内容：1.通过克隆文库和PCR-DGGE的方法确定梭子蟹养殖塘水体中细菌的多样性；2.通过测序和系统发育分析确定细菌的系统发育关系。拟解决的问题：确定三疣梭子蟹养殖塘水体中细菌的多样性，并分析其在不同养殖阶段的群落差异。三、研究的方法与技术路线：（一）研究方法1.样品的采集我们对宁海县明港东坝的三

6、疣梭子蟹养殖塘进行为期两个月的跟踪调查。调查期间分批次的采集水样，采样间隔为20～30d。采样时间为上午11:00～13:00，水样的采集方法遵照《海洋调查规范》第6部分：海洋生物调查(GB/T12763.6-2007）的要求进行，应用深水采样器采集水样，采样前，开动水车30分钟，以使水体充分混匀，从深度约0.5m处取水，采样量为5L，共采样3次。样品采集后立即置于黑暗、4℃的环境保存,采集4h内进行后续实验。2.菌体收集采用MILLIPORE过滤浓缩系统收集水样中的菌体，用Φ1μm的微孔滤膜进行预过滤，去除水中漂浮的杂质和一些较

7、大的真核单细胞浮游生物。过滤水样的体积为2L，收集滤液，将滤液经过Φ0.22μm的微孔滤膜再次过滤，菌体被截留在滤膜上。在无菌操作条件下，将滤膜剪碎后，置于50ml无菌聚乙烯离心管中待用。3.样品总DNA提取：3.1试剂溶菌酶缓冲液40mMEDTA，pH8.050mMTris-cl，pH8.010％(m/V）蔗糖用0.22µm的过滤器过滤除菌，4℃保存。STE缓冲液：10mMEDTA，pH8.025mMTris-Cl，pH8.050mM葡萄糖121℃灭菌20min，4℃保存。1×工作液，pH8.0：1mMEDTA，pH8.010m

8、MTris-Cl，pH8.0TE缓冲液100mMTris-Cl，pH8.010mMEDTA，pH8.010×贮存液，pH8.0：分装后121℃灭菌20min，室温保存。3.2SDS-煮沸法提取DNA:①向M1管中加入5mlSTE缓冲液，在漩涡混合器