渗透压对产甘油假丝酵母甘油合成与胞内磷积累的影响

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1、中国生物工程杂志ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００９，２９（４）：６１～６６渗透压对产甘油假丝酵母甘油合成与胞内磷积累的影响１，２２２２谢涛方慧英诸葛斌诸葛健（１湖南工程学院化学化工系湘潭４１１１０４２江南大学工业生物技术教育部重点实验室无锡２１４０３６）摘要研究了不同磷浓度时渗透压对产甘油假丝酵母甘油合成与胞内磷积累的影响。结果表明，不同磷含量时，产甘油假丝酵母甘油合成越多，分泌至胞外和积累于胞内的甘油也越多，其最大甘油合成量存在一个最适渗透压。同样；在相同渗透压下，其最大甘油合成量也存在一个最适磷浓度。在相同磷含量时，渗透压增高能够促进胞内聚磷酸盐积累；

2、当渗透压相同时，培养基中磷含量增加，胞内游离磷和聚磷酸盐均增加。在生长稳定期后期，富磷可以促进胞内游离磷和聚磷酸盐积累显著增加。经分析发现，产甘油假丝酵母胞内积累甘油与聚磷酸盐，可能对克服对数生长期细胞数量少而渗透压胁迫大的困境发挥了极其重要的作用，从而能维持其生长稳定期较高的生物量、细胞存活率和甘油产量。关键词渗透压甘油合成胞内磷积累产甘油假丝酵母中图分类号ＴＱ９２甘油作为酵母渗透压调节中相容性溶质的重要意义物研究中心提供。已成为公认的事实，且胞内甘油浓度受胞外渗透压调种子培养基（ｇ／Ｌ）：葡萄糖１００，尿素２，玉米浆８，［１～４］节。在渗透压胁迫过程中，Ｓａｃｃｈａｒｏ

3、ｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ积自然ｐＨ值。累甘油的一个重要途径是增加其甘油的合成速率。同时，合成发酵培养基（ｇ／Ｌ）：葡萄糖１７０～１８０，ＫＨＰＯ２４有些酵母菌也能通过在其胞内积累聚磷酸盐（ＰｏｌｙＰ），增强０．４（适磷）、０．８、１．２和１．６（富磷），ＭｇＳＯ·７ＨＯ４２其对营养饥饿、化学抑制剂、重金属污染、紫外辐射、氧化破０．５，ＣａＣｌ０．１，微量元素溶液１ｍｌ／Ｌ，ｐＨ值不调，其渗２坏、高温、强酸强碱和高盐高渗等不良环境的抵抗力，从而透压通过调节ＮａＣｌ浓度来控制。［５～８］提高在生长稳定期的存活率。因此，为了较清楚地了１．２发酵方法解Ｃａｎｄｉｄａｇｌｙｃｅ

4、ｒｉｎｏｇｅｎｅｓ产甘油发酵过程中高渗透压、甘从刚转接培养好的新鲜斜面上挑取一环菌株，接油合成与ＰｏｌｙＰ积累之间的关系，本文将针对不同磷酸盐入５００ｍｌ摇瓶中（种子培养基装液量为５０ｍｌ），于往复浓度下渗透压对Ｃ．ｇｌｙｃｅｒｉｎｏｇｅｎｅｓ甘油合成与胞内ＰｏｌｙＰ式摇床上３０℃振荡（振幅１０ｃｍ，振动频率１１０次／ｍｉｎ）积累的影响开展研究，以期为进一步揭示ＰｏｌｙＰ的生理作培养１９ｈ即可用于接种。再按５％（ｖ／ｖ）的接种量将种用打下基础。子液接入装有６０ｍｌ合成发酵培养基的５００ｍｌ摇瓶中进１材料和方法行发酵，发酵条件同种子培养。１．３测定方法１．１菌株和培养基［９］

5、１．３．１甘油的测定采用高碘酸钠变色酸法。菌株：Ｃａｎｄｉｄａｇｌｙｃｅｒｉｎｏｇｅｎｅｓ由江南大学工业微生［１０］１．３．２生物量的测定采用菌体干重（ＤＣＷ）法。收稿日期：２００８１１１９修回日期：２００８１２１１１．３．３胞内游离磷、ＰｏｌｙＰ与甘油的提取按Ｓｈｉ湖南省自然科学基金（０７ＪＪ６０３１）、湖南省应用化学重点建设学［１１］［１２］科基金（２００８ｚｊｘｋ１０２）资助项目等和Ｍｃｇｒａｔｈ等的方法，并略做改动。取一定量电子信箱：ｘｔ１１０５＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ的发酵液离心，菌体用去离子水反复洗涤、离心两次，６２中国生物工程杂志ＣｈｉｎａＢ

6、ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＶｏｌ．２９Ｎｏ．４２００９［１２］湿菌体与０．１５％（活性氯浓度）的次氯酸钠溶液按１∶５量。胞内甘油、胞内游离磷和胞内ＰｏｌｙＰ均表示成（ｗ／ｖ）的比例混合均匀，于２５℃下反应４５ｍｉｎ后离心，单位质量干菌体中所含该物质的质量，单位为ｍｇ／ｇ菌体用去离子水反复洗涤、离心两次；然后，用适量去ＤＣＷ。离子水萃取两次（每次的萃取时间为２ｈ，且每隔３０ｍｉｎ２结果与分析振荡混匀一次），并于４０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，萃取液合并入５０ｍｌ容量瓶中，用去离子水定容摇匀；分别取萃２．１不同磷含量条件下渗透压对胞内甘油与胞内磷取液１０ｍｌ、５ｍｌ用于测定胞内甘

7、油和游离磷含量。积累的影响［１３］１．３．４游离磷（Ｐｉ）的测定采用钼蓝比色法。图１和图２反映了Ｃ．ｇｌｙｃｅｒｉｎｏｇｅｎｅｓ在初始葡萄糖１．３．５ＰｏｌｙＰ的测定取一定量上述胞内萃取液，按１浓度为１７５ｇ／Ｌ而ＫＨＰＯ浓度和渗透压不同的培养２４∶５加入浓盐酸于１００℃水浴锅中水解５０ｍｉｎ，再测定总基中发酵一定时间后甘油合成与胞内磷积累的结果。磷的含量，总磷含量减去游离磷含量即得ＰｏｌｙＰ含图１不同磷含量条件下渗透压对胞外甘油（ａ）与胞内甘油（ｂ）含量的影响Ｆｉｇ．１Ｅｆｆｅｃｔｏｆｏｓｍｏｔｏｌｅｒａｎｃｅｏ