产甘油假丝酵母酸调控启动子及其应用研究

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1、１０分类号：Ｑ９３９．９单位代码：７２０密级：公开学号：１５０７１００５０１ＳｈａａｎｘｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ硕士学位论文产甘油假丝酵母酸调控启动子及其应用研究ＳｔｕｄｏｎａｃｉｄｒｅｕｌａｔｉｏｎｒｏｍｏｔｅｒｓｏｆＣａｎｄｉｄａｙｇｐｇｌｃｅｒｉｎｏｅｎｅｓａｎｄｉｔｓａｌｉｃａｔｉｏｎｙｇｐｐ论文作者：何强指导教师、职称：陈文强教授解修超副教授联合培养导师：诸葛斌教授学科、专业名称：微生物学研究方向：微生物资源保育与应用开发二○一八年六月分类号：Q939.9单位代码：10720密

2、级：公开学号：1507100501硕士学位论文产甘油假丝酵母酸调控启动子及其应用研究StudyonacidregulationpromotersofCandidaglycerinogenesanditsapplication论文作者：何强指导教师、职称：陈文强教授解修超副教授联合培养导师：诸葛斌教授学科、专业名称：微生物学研究方向：微生物资源保育与应用开发二○一八年六月摘要有机酸作为平台化学品被广泛应用于食品、化工、医药等领域，微生物发酵法是其生产的主要方法之一，然而，工业发酵普遍面临酸抑制，不仅影响细胞正常生长代谢导致生产效率低下，而且通过NaOH等进行酸度调节，致使发酵液渗透压提

3、高和下游分离困难。常用表达系统中很少有以产物有机酸为诱导剂的启动子，解决酸发酵难题的途径可采用耐酸性强工业微生物结合酸诱导启动子的应用改造。产甘油假丝酵母（Candidaglycerinogenes）是一株耐高渗和耐酸特性强的优异工业菌株，本研究对该菌株酸调控新型启动子的研究将为工业酵母基因改造、有机酸生产提供基础。具体研究如下：通过C.glycerinogenes与酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）有机酸和pH耐受性差异分析结合实时荧光定量PCR（qRT-PCR）方法，在pH2.5下，比较酸胁迫应答基因的相对转录水平获得相对转录水平大于5的四个酸胁迫应答基因

4、GMT、GUK、ADH3和TPO2；其中GMT基因在不同pH条件下转录水平变化最显著；通过克隆技术获得启动子PCgGMT、PCgGUK、PCgADH3和PCgTPO2，并利用MatInspector软件对启动子序列中潜在的酸应答相关转录因子结合位点进行生物信息学分析。为考察酸调控启动子性能，分别构建以PCgGMT、PCgGUK、PCgADH3和PCgTPO2为启动子，以绿色荧光蛋白基因GFP为报告基因的整合表达载体，利用醋酸锂转化法导入C.glycerinogenes，利用荧光显微镜检测各重组细胞内GFP在不同pH条件下的表达强弱，荧光观察结果通过Image-ProPlus进行光密度

5、（IOD）分析计算其荧光强度，评价启动子的启动强弱；结果表明，PCgGMT、PCgGUK、PCgADH3和PCgTPO2均能启动下游GFP基因表达，其荧光强度随pH的降低而增强，确定所筛选到的启动子均受到酸的调控；为考察酸诱导启动子的通用性，以S.cerevisiae模式菌株为宿主细胞，在不同pH条件下检测GFP荧光并分析，结果表明：启动子均能在S.cerevisiae中启动GFP基因表达。利用4类酸（磷酸、盐酸、柠檬酸和乙酸）进一步考察PCgGMT、PCgGUK和PCgADH3受不同酸诱导表达GFP基因的性能，由结果可知，无机酸诱导能力稍强于有机酸，但是差异并不显著，表明启动子诱导

6、能力主要受H+调控，受酸根的影响较小。为研究酸诱导启动子的工业化应用，尝试用酸诱导水平最显著的PCgGMT启动子i在C.glycerinogenes中生产乳酸，以丝状真菌RhizopusoryzaecDNA为模板，克隆得到1067bp的乳酸合成关键基因ldhA，连接到以PCgGMT为启动子的表达载体中，将表达载体导入C.glycerinogenes获得产乳酸重组菌并考察发酵性能，由结果可知，重组菌在pH2.5条件下具有更高的比酶活，为13.83mU/mg，乳酸积累量12.32g·L-1，是pH5.5时的3.18倍，表明PCgGMT能够在低pH条件下增强乳酸脱氢酶基因的表达，使转化子具

7、有更强的乳酸合成能力。关键词：产甘油假丝酵母；有机酸；调控；启动子；乳酸iiAbstractOrganicacidsarewidelyusedasplatformchemicalsinchemical,pharmaceutical,foodandotherfields.Microbialfermentationisoneofthemainmethodsofproduction.However,industrialfermentationisgenerall