产甘油假丝酵母产甘油关键酶基因

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1、产甘油假丝酵母产甘油关键酶基因在酿酒酵母中的表达*中国生物工程杂志ChinaBiotechnology,2006,26(1):38～41赵有玺1,2饶志明1**沈微1方慧英1诸葛健1**（1江南大学工业生物技术教育部重点实验室江南大学生物工程学院工业微生物研究中心无锡214036)(2北京联合大学生物化学工程学院北京100023）摘要甘油是一种极其理想的耐高渗透压介质。利用PCR方法，从产甘油假丝酵母WL20025中扩增出了2个产甘油的关键酶基因GPD和GPP，分别编码3磷酸甘油脱氢酶（glycerol3phosphatedehydrogenase,GPD）和3

2、磷酸甘油磷酸酶（glycerol3phosphatephosphatase,GPP）。利用TVector在EscherichiacoliJM109中克隆得到大量的GPD和GPP基因，并成功构建了重组质粒pYX212GPD和pYX212GPP；通过LiAc转化法将重组质粒导入酿酒酵母SaccharomycescerevisiaeW3031A。初步实验结果表明：发酵过程中pYX212GPD/S.cerevisiaeW3031A的生物量高于pYX212GPP/S.cerevisiaeW3031A和野生型S.cerevisiaeW3031A；发酵72h后

3、，pYX212GPD/S.cerevisiaeW3031A发酵液中甘油含量大约为12mmol/L，明显高于野生型S.cerevisiaeW3031A的甘油含量，而pYX212GPP/S.cerevisiaeW3031A与野生型S.cerevisiaeW3031A在甘油含量上相差不大，均只有4mmol/L左右。关键词甘油3磷酸甘油脱氢酶3磷酸甘油磷酸酶酵母工程菌中图分类号Q786收稿日期：20050309修回日期：20050922*国家自然科学基金资助项目（30300027），江南大学工业生物技术教育部重点实验室开放基金资助项目（KLIBKF2

4、00507），江南大学预研基金资助项目（0004402）**通讯作者，电子信箱：raozm@yahoo.com.cn甘油是一种极其理想的耐高渗透压介质。当环境渗透压升高时，酿酒酵母将合成并在胞内积累甘油以维持细胞内外的渗透压平衡；当在缺氧条件下生长时，酿酒酵母将合成并在胞内积累甘油以维持细胞的氧化还原平衡［1］。存在于胞浆中的3磷酸甘油脱氢酶，以NAD+为辅酶，催化磷酸二羟丙酮生成3磷酸甘油，然后3磷酸甘油磷酸酶催化3磷酸甘油生成甘油［1］。耐高渗产甘油假丝酵母WL20025是江南大学科研人员从5000株耐高渗酵母中分离得到的一株过量合成甘油的菌株,可以分别

5、在含25％葡萄糖和5％NaCl的高渗透压培养基上正常生长［2］。最近，本研究组已进一步阐明过量合成甘油是该菌株耐高渗性能的物质基础［3］，而甘油合成关键酶胞浆3磷酸甘油脱氢酶的组成型高表达则是其过量合成甘油的重要原因［4］。运用穿梭载体已经构建了产甘油假丝酵母质粒基因文库［5］，应用遗传互补法已克隆出产甘油假丝酵母甘油合成途径中的关键酶——胞浆3磷酸甘油脱氢酶和3磷酸甘油磷酸酶的编码基因GPD和GPP［6］。从产甘油假丝酵母WL20025扩增出其甘油合成关键酶基因GPD与GPP。同时在E.coliJM109中成功构建了分别含上述2基因的表达载体pYX212G

6、PD和pYX212GPP；然后通过LiCl高效转化法将重组质粒导入酿酒酵母S.cerevisiaeW3031A中；并通过发酵实验探索异源基因的表达对S.cerevisiaeW3031A中甘油的累积和对生物量的影响。1材料与方法1.1材料1.1.1菌株及质粒产甘油假丝酵母WL20025，酿酒酵母S.cerevisiaeW3031A，E.coliJM109及质粒pYX212由本实验室保藏。1.1.2主要试剂和工具酶质粒小量抽提试剂盒（碧云天生物技术研究所），胶回收试剂盒（上海华舜公司），pEGMTEasyvector(Promega公司)，工具酶（Mathe

7、maticalBiosciencesInstitute公司）。1.1.3PCR引物GPD上游引物：5′CGCGAGCTCGGGGAAGTATGATATGTTATCTTTCTC3′，GPD下游引物：5′CGCGGATCCCCCCTCCACAAACACAAATATTGATAA3′，GPP上游引物：5′CGCGAGCTCTTGGTCGGAATATGACTTAAATCATAC3′，GPP下游引物：5′CGCGGATCCTATACTAACCATCGCAATGCCTTTGAC3′，均由上海生物工程有限公司合成。上游引物和下游引物分别在5′端引入S