豆状带绦虫线粒体rrnL和nad5基因的克隆及种系发育研究-论文.pdf

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1、中国畜牧兽医2013年第4O卷第6期生物技术·45·豆状带绦虫线粒体rrnL和nad5基因的克隆及种系发育研究范艺凡-一。刘国华。，杨言川，韩进欢，朱兴全，蒋文灿，孙晓林(1．中国农业科学院兰州兽医研究所，家畜疫病病原生物学国家重点实验室，甘肃兰州730046；2．四川农业大学动物医学院，四川雅安625014；3．湖南农业大学动物医学院，湖南长沙410128；4．甘肃农业大学动物医学院，甘肃兰州730070)摘要：本研究旨在阐明中国豆状带绦虫囊尾蚴河南分离株线粒体核糖体大亚基基因(rrnL)部分

2、序列(prrnL)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)脱氢酶亚单位5基因(nad5)部分序列(pnad5)的遗传变异情况，并用prrnL和pnad5序列重构豆状带绦虫与其他带科绦虫的种系发育关系。采用聚合酶链式反应(PCR)，扩增豆状带绦虫囊尾蚴分离株的线粒体prrnL和pnad5，将所测的序列用PAuP4．0Beta10程序MP法绘制种系发育树，利用DNAStar5．0中的MegAlign程序进行同源性分析。所获得的豆状带绦虫线粒体prrnL长度约为847bp，pnad5为602bp。所获rrn

3、L序列与GenBank中豆状带绦虫相应序列的相似性为99．1～100，nad5为99．2～100；河南分离株之间rrnL序列的相似性为99．65，nad5为99．5；与GenBank中其他带科绦虫序列的相似度rrnL低于83．4，nad5低于85．7。种系发育分析结果表明，所有豆状带绦虫分离株和已知豆状带绦虫位于同一分支。由于豆状带绦虫分离株的线粒体rrnL和nad5基因序列种内很保守，种间差异较大，故可作为带科绦虫种间遗传变异研究的标记。关键词：豆状带绦虫；线粒体DNA；rrnL基因；nad5

4、基因；种系发育关系中图分类号：Q78文献标识码：A文章编号：1671—7236(2013)06—0045—04豆状囊尾蚴病是由带科(Taeniidae)带属(Tae—因具有分子质量小、结构简单、母系遗传、进化速率nia)的豆状带绦虫的中绦期蚴虫豆状囊尾蚴(Cys—快和高度保守等特点，其一些基因已经广泛应用于ticercuspisiformis)寄生于家兔的肝脏、网膜、肠系寄生虫的种问和种内遗传变异(Jia等，2010；Mc—膜及直肠浆膜等处所引起的一种绦虫蚴病(YangManus等，1996；H

5、U等，2004；Liu等，2O11，2012)。等，2012)。当终末宿主(如犬、狼、狐等食肉动物)吞线粒体DNA序列对研究寄生虫的分类和鉴定、物食了感染豆状囊尾蚴的中间宿主后，囊尾蚴在宿主种遗传学、群体遗传学、进化生物学起到了重要的作小肠内发育为豆状带绦虫(Taeniapisiformis)用。因此，本研究应用PCR方法扩增出河南兔体内(Toral—Bastida等，2011)。该病在世界范围内广泛采集的豆状囊尾蚴的线粒体核糖体大亚基基因流行，不仅对公共卫生及社会安全构成严重威胁，而(rrnL

6、)部分序列(prrnL)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸且给养兔业造成巨大经济损失。然而，发展中国家(NADH)脱氢酶亚单位5基因(nad5)部分序列对豆状囊尾蚴病的检测和治疗还没有给予足够的重(pnad5)，并利用prrnL和pnad5重构豆状带绦虫与视(Pawlowski等，2005)。因此正确鉴别豆状囊尾其他带科绦虫的种群遗传关系，从而明确豆状带绦蚴病，不仅具有重要学术价值，而且对预防、检测和虫线粒体rrnL和nad5基因部分序列能否成为理治疗该病具有重要意义。动物的线粒体基因组想的种间遗传标记。(

7、mtDNA)一般由一个紧闭的环状DNA组成，大小1材料与方法在14～16kb之间(Boore，1999)。线粒体基因组1．1虫体样品本试验共使用l1个豆状带绦虫囊尾蚴样品，其中4个采自河南省郑州市的4只自然收稿日期：2012-11-19感染家兔；7个采自试验感染的家兔。试验感染家作者简介：范艺凡(1987)，女，四JI1人，硕士生，研究方向：寄生兔用的豆状带绦虫成虫采自河南省郑州市的可自然虫分子生物学。感染家兔的豆状带绦虫囊尾蚴感染的家狗(表1)。通信作者：孙晓琳。E-mail：ndsxl@ya

8、hoo．com．crl1．2主要试剂rTaq酶及PCR试剂(Buffer、基金项目：全国农业科研杰出人才项目；家畜疫病病原生物学国MgC1、dNTPs)均购自宝生物工程(大连)有限公家重点实验室开放基金(sKLVEB2O1OKFKTO1O、SKLVEB2011KFKT004)。司；蛋白酶K购自Merck公司；TIANampGenomic·46·生物技术中国畜牧兽医2013年第40卷第6期1．3样品DNA的制备从7O酒精保存液中取1O×PCRBuffer2．5L，rTaqPolymerase(5U