青霉素酰化酶交联酶聚体的制备及热失活动力学

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1、V01．35高等学校化学学报No．62014年6月CHEMICALJOURNALOFCHINESEUNⅣERSITIES12l2～12l8青霉素酰化酶交联酶聚体的制备及热失活动力学慕洋洋，甄倩楠，王梦凡，齐崴，苏荣欣，何志敏(1．天津大学化工学院，化学工程联合国家重点实验室，2．食品工程系，天津300072)摘要以0．53g／mL硫酸铵为沉淀剂，0．35％(体积分数)戊二醛为交联剂制得青霉素酰化酶交联酶聚体(CLEAs)，酶活收率30．1％，其最适温度(57℃)比游离酶提高10℃，最适pH(10．0)向碱性偏移1．7个单位．对比

2、游离酶及其CLEAs的热稳定性和热失活动力学模型发现，游离青霉素酰化酶制成CLEAs后，其热失活动力学模型由一步失活转变为连串失活，失活反应活化能由248．8kJ／mol增加至549．2kJ／mol，对CLEAs热稳定性大幅提高的原因进行了解释．CLEAs重复利用7次后，酶活保留56％以上，具有良好的重复利用性．关键词交联酶聚体；青霉素酰化酶；固定化；稳定性；热失活动力学中图分类号0629．8；Q814．2文献标志码A青霉素酰化酶(Penicillinacylase，E．C．3．5．1．11)¨是生产半合成抗生素的关键酶，可催化

3、青霉素和头孢菌素发生脱酰反应，生成JB一内酰胺类抗生素(青霉素类和头孢菌素类)的母核6．氨基青霉烷酸(6-APA)和7一氨基一3一脱乙酰氧基头孢烷酸(7-ADCA)，在制药领域应用广泛．此外，青霉素酰化酶也被广泛用于手性化合物的酶法合成与拆分J，IJi等利用青霉素酰化酶合成了具有不同旋光性的-苯丙氨酸；Cabrera等利用固定化青霉素酰化酶拆分了(±)一甲基苯丙二酸等．工业生产中通常使用固定化的青霉素酰化酶．目前，已有多种方法被用于青霉素酰化酶的固定化，如Zhou等将青霉素酰化酶固定在经不同亲疏水性离子液体修饰的磁性硅纳米球复合

4、材料上，展现出较强的活性、较高的稳定性和重复利用率；Chen等将金属离子亲和色谱法与膜工艺有机结合，制得金属离子亲和膜，并将青霉素酰化酶固定在此材料上，极大提高了酶在缓冲液中的储藏稳定性．与游离酶相比，固定化酶在变化的外界条件下更稳定，可操作性更强。交联酶聚体(Cross．1inkedenzymeaggregates，CLEAs)lo]是一种新型无载体固定化酶技术，在溶液中使酶蛋白分子发生物理聚集，随后利用交联剂戊二醛对聚集体进行化学交联，从而稳定天然酶分子．该方法制备过程简便，所得固定化酶稳定性强，易于回收和重复利用．由于CL

5、EAs全部由酶蛋白组成，未引入载体，避免了载体材料对反应体系的污染，单位质量酶活高，制备成本低，展现出很好的应用前景．Hormigo等将制得的聚羟基丁酸酯(PHB)解聚酶CLEAs用于PHB的水解反应，连续反应20次，酶活无损失；Sinirlioglu等¨利用漆酶cLEAs进行工业孔雀石绿染料的脱色，发现CLEAs在55℃仍具有70％的保留酶活，显示出比游离酶更高的稳定性，并且脱色活性提高近200％．高温可以提高酶的催化效率，但同时也会造成酶的热失活．游离酶经过固定化后其热稳定性会有所提高．因此，本文对青霉素酰化酶CLEAs的制

6、备工艺和应用条件进行了系统考察，并在此基础上与游离酶对比研究了其热稳定性，通过热失活动力学分析，解释了CLEAs具有优良热稳定性的原因．1实验部分1．1试剂与仪器青霉素酰化酶(浙江顺风海德尔有限公司)；BCA蛋白试剂盒(碧云天生物技术公司)；硫酸铵、对收稿日期：2013—10—15．基金项目：国家自然科学基金(批准号：31071509，21206113)和天津市应用基础研究计划项目(批准号：13JCQNJC09300)资助联系人简介：齐崴，女，博士，教授，主要从事酶工程与生物催化研究．E-mail：qiwei@tju．edu．c

7、n王梦凡，女，博士，讲师，主要从事酶工程研究．E—mail：mwang@tju．edu．cn慕洋洋梅等：青霉素酰化酶交联酶聚体的制备及热失活动力学二甲氨基苯甲醛(PDAB)、乙酸、氢氧化钠、50％戊二醛和青霉素钠盐等均为市售分析纯试剂．SW22型恒温水浴摇床(瑞士Julabo公司)；ZD一2型pH计(上海雷磁仪器厂)；AnkeTGL一16C高速离心机(上海安亭科学仪器厂)；3．18K型低温离心机(美国Sigma公司)；U-2001型紫外分光光度计(Ft本Hitachi公司)．1．2实验过程1．2．1青霉素酰化酶CLEAs的制备取

8、1mL酶液，加入适量饱和硫酸铵至一定浓度后混合均匀，静置沉淀30min，随后向悬浊液中加入50％(体积分数)戊二醛至一定浓度，并于室温交联2h．取交联后的混合物，以10000r／min转速离心1min，将沉淀用5mL缓冲液反复洗涤3次，置于4℃冰箱中保存．1．2