青霉素酰化酶的固定化与应用新进展论文

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1、青霉素酰化酶的固定化与应用新进展论文周成王安明王华杜志强祝社民杨明张俊沈树宝【摘要】青霉素酰化酶被广泛应用于半合成抗生素及中间体的制备、手性药物的拆分和多肽合成等方面。高效固定青霉素酰化酶能提高酶对温度、pH值、溶剂极性等方面的适用性和反复使用的稳定性，将成为拓宽青霉素酰化酶在工业中应用的必然选择和关键。本文主要介绍了青霉素酰化酶固定化技术的进展，讨论了不同固定化技术的特点和固定化酶在非水相体系中的催化作用，并展望了固定化青霉素酰化酶的发展前景。【关键词】青霉素酰化酶；载体；固定化；反应介质；固定化酶的应用ABSTRACTPenicillinacylaseisis

2、yntheticantibioticsandintermediatespreparation,separationofchiralpoundsandpeptidesynthesis.Thehighefficientimmobilization,perature,pH,polarityandthestabilityofitsreuse,eofpenicillinacylase.CM48介孔分子筛为载体，固定青霉素酶12h，相对活力65.10%；肖清贵等［10］研制的中空硅微管载体，负载率和活力回收分图1青霉素酰化酶与高密度环氧载体共价结合过程别为97.20%和88.

3、80%；Bernardino等［11］研制的磁性硅载体可减少扩散阻力，便于催化剂分离回收；王卫等［12］研究的磁性环氧颗粒载体最适pH和温度分别为8.5和45℃，交联密度为30%，固定化酶经使用80次仍保持94.2%的催化活力。采取对无机载体先表面修饰再与酶固定的方法，性能有很大提高。本课题组曾采用表面氨基的介孔二氧化硅固定青霉素酰化酶［13］，相对活力达90%以上，循环使用10次后催化活力仍保持初始条件的94%。此外选用介孔泡沫硅(MCFs)载体固定青霉素酰化酶，制得的MCFs载体［14，15］经电镜检测，颗粒表面密集分布大量孔道，孔径较大呈泡沫状。由BET法计算

4、得到MCFs的比表面积为331.43m2/g。由BJH公式计算得到的孔体积及平均孔径分别为2.16cm3/g和26nm。固定化酶负载率约95%，催化活力最高达200U/mg以上，载体性能较好。1.3复合载体有机载体和无机载体各有优势。有研究立足于结合这两种材质的载体，改进材料的性能，如针对壳聚糖颗粒机械强度不够和比表面积不大的缺点，用无机多孔材料硅藻土在低压下强化吸附壳聚糖以固定青霉素酰化酶，优化机械强度，固定化酶性能得到提高［16］。2青霉素酰化酶的固定化方法固定方法的选择是酶与载体固定过程的关键步骤。载体固定通常有吸附法、包埋法和共价偶联法；无载体固定法常用无载

5、体交联酶和交联酶聚集体两种，不同固定化方法优缺点如表1所示。2.1载体固定法吸附法通过载体表面与酶表面次级键互相作用固定，可分为物理吸附和离子吸附。物理吸附要求载体表面对蛋白质有高吸附性。离子吸附是利用酶解离状态图2带氨基的硅载体与青霉素酰化酶共价固定的过程表1不同固定方法的原理及优缺点分类方法优点缺点文献载体固定法吸附法条件温和，操作简便酶负载强度低，易失活［17］包埋法酶本身不参与结合，简单易行扩散阻力问题，酶包埋中易失活［18］共价偶联法具有良好的稳定性酶活损失很大［19］无载体固定法无载体交联酶(CLECs)酶载容量较高，利于底物扩散产物分离。在合成中能获得

6、较高反应速率，晶体颗粒小，在高剪切力和液体运输下具有良好的机械稳定性和化学稳定性。比固定化酶制备过程复杂［8，20］交联酶聚集体(CLEAs)避免耗时纯化，酶不易破坏可回收使用，催化水解重复20批次可保持100%活力。半合成抗生素产率高。对于较大分子量的酶形成聚集体效果不佳［21～26］下与载体的电荷正负相吸原理固定酶。包埋法［18］将酶包埋进载体孔径内固定，酶本身并不参与结合。共价偶联法是利用酶的非必需侧链基团与载体的功能基团形成稳定的共价键而固定。本课题采用MCFs载体、交联剂对苯醌和青霉素酰化酶共价结合，经0.1mol/LNaCl溶液洗涤后，固定化酶负载率和酶

7、活与未洗涤的固定化酶相比没有明显下降，证明载体MCFs与青霉素酰化酶是共价而非吸附固定。2.2无载体固定法(1)交联酶晶体(CLECs)晶体晶格中蛋白质浓度接近理论极限，浓缩的蛋白形成晶体，通过戊二醛等多功能试剂将酶永久交联，分子中静电反应和疏水反应数量增加，明显增强了蛋白质的稳定性。交联酶晶体可用于多肽合成、酶传感器、化妆品和洗涤剂等需要高稳定性和高活性蛋白质的领域，应用前景广泛。(2)交联酶聚集体(CLEAs)CLEAs的活性和稳定性可与CLECs相媲美。在CLEAs制备中，浓缩的酶蛋白会发生物理聚集而形成超分子结构，加入无机盐、有机溶剂或其他大分子试剂可使