青霉素酰化酶的固定化与应用新进展

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1、青霉素酰化酶的固定化与应用新进展作者：周成王安明王华杜志强祝社民杨明张俊沈树宝【摘要】青霉素酰化酶被广泛应用于半合成抗生素及中间体的制备、手性药物的拆分和多肽合成等方面。高效固定青霉素酰化酶能提高酶对温度、pH值、溶剂极性等方面的适用性和反复使用的稳定性，将成为拓宽青霉素酰化酶在工业中应用的必然选择和关键。本文主要介绍了青霉素酰化酶固定化技术的进展，讨论了不同固定化技术的特点和固定化酶在非水相体系中的催化作用，并展望了固定化青霉素酰化酶的发展前景。【关键词】青霉素酰化酶；载体；固定化；反应介质；固定化酶的应用ABSTRACTPenicillinacylaseisisynthe

2、ticantibioticsandintermediatespreparation,separationofchiralpoundsandpeptidesynthesis.Thehighefficientimmobilization,perature,pH,polarityandthestabilityofitsreuse,eofpenicillinacylase.ateo等［5］选用EPSepabeads类高密度环氧结构的载体固定青霉素酰化酶，过程如图1所示。Pasini等［6］研究EupergitC载体固定化酶，催化活力较游离酶明显增加，重复使用稳定性好。1.2无机分子载

3、体随着材料学的迅速发展，出现了具有多维孔道结构介孔分子筛的载体，可制备高活性高稳定性的固定化酶。何静等［7］报道的介孔分子筛MCM41具有高比表面积、较小扩散阻力的特点，可吸附固定，也可利用载体表面醛基与酶蛋白的氨基相互反应共价连接。Roger等［8］实验表明MCM41载体的孔径(3～3.5nm)明显小于青霉素酰化酶尺寸(7nm×5nm×5nm)，载体可大部分与酶以吸附形式固定。Roger等研究了硅载体通过交联剂与酶共价固定的过程，如图2所示。此硅载体孔径较大，固定化酶的干酶活力达110BPUg-1，活力回收80%，热稳定性明显优于EupergitC固定化酶。薛屏等［9］以

4、MCM48介孔分子筛为载体，固定青霉素酶12h，相对活力65.10%；肖清贵等［10］研制的中空硅微管载体，负载率和活力回收分图1青霉素酰化酶与高密度环氧载体共价结合过程别为97.20%和88.80%；Bernardino等［11］研制的磁性硅载体可减少扩散阻力，便于催化剂分离回收；王卫等［12］研究的磁性环氧颗粒载体最适pH和温度分别为8.5和45℃，交联密度为30%，固定化酶经使用80次仍保持94.2%的催化活力。采取对无机载体先表面修饰再与酶固定的方法，性能有很大提高。本课题组曾采用表面氨基的介孔二氧化硅固定青霉素酰化酶［13］，相对活力达90%以上，循环使用10次后催

5、化活力仍保持初始条件的94%。此外选用介孔泡沫硅(MCFs)载体固定青霉素酰化酶，制得的MCFs载体［14，15］经电镜检测，颗粒表面密集分布大量孔道，孔径较大呈泡沫状。由BET法计算得到MCFs的比表面积为331.43m2/g。由BJH公式计算得到的孔体积及平均孔径分别为2.16cm3/g和26nm。固定化酶负载率约95%，催化活力最高达200U/mg以上，载体性能较好。1.3复合载体有机载体和无机载体各有优势。有研究立足于结合这两种材质的载体，改进材料的性能，如针对壳聚糖颗粒机械强度不够和比表面积不大的缺点，用无机多孔材料硅藻土在低压下强化吸附壳聚糖以固定青霉素酰化酶，优化

6、机械强度，固定化酶性能得到提高［16］。2青霉素酰化酶的固定化方法固定方法的选择是酶与载体固定过程的关键步骤。载体固定通常有吸附法、包埋法和共价偶联法；无载体固定法常用无载体交联酶和交联酶聚集体两种，不同固定化方法优缺点如表1所示。2.1载体固定法吸附法通过载体表面与酶表面次级键互相作用固定，可分为物理吸附和离子吸附。物理吸附要求载体表面对蛋白质有高吸附性。离子吸附是利用酶解离状态图2带氨基的硅载体与青霉素酰化酶共价固定的过程表1不同固定方法的原理及优缺点分类方法优点缺点6.2酶法合成用6APA、7ADCA等中间体与新的D氨基酸类在酸性条件下可合成各种具有新的抗菌活性和抗

7、菌谱的半合成抗生素。固定化酶的酶法合成具有反应条件温和、工艺操作简单、无需基团保护等优势。已报道的酶法合成产品有阿莫西林［51］、头孢氨苄［52，53］和氨苄西林［54］(图4)等。热力学分析推测固定化青霉素酰化酶在非水相中的合成产率高于水溶液，可避免游离酶的不稳定性，但影响酶构象。动力学分析合成过程不可避免地发生酶解反应，最终达到动态平衡，工业生产中此过程对高产率的获得很不利。补充高浓度的侧链供图4酶法催化水解制备6APA和半合成氨苄青霉素体和母核可减少水解的发生。可通过提取产物促进酶促