合成用青霉素酰化酶的发酵与酶法合成头孢克洛

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1、TheFermentationProcessofPenicillinAcylaseandPreparationofCatalyticbyenzymaticmethodbyWEIXiaojuAthesissubmittedinpartialsatisfactionoftheRequirementsforthedegreeofMasterofScienceMicrobiologyCentralSouthUniversityofForestryandTechnology498ShaoshanSouthRoad，Tian

2、xinDistrictChangshaHunan410004，ER．CHINASupervisorProfessorLIJilieMay,2014本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写的成果作品，也不包含为获得中南林业科技大学或其他教育机构的学位或证书所使用过的材料。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式表明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。作者签名：j多匈b芍7^伽／

3、9-年夕月砷日

4、中南林业科技大学学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件或电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权中南林业科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于：1、保密口，在年解密后适用本授权书。2、不保密留。(请您在以上相应方框打“4”)作者签名：易啵萄沙烨年岁月7刁日摘要青霉素酰化酶作为一种重要的医药工业用酶，在半合成夕．内酰胺

5、抗生素和医药中间体的生产、多肽合成以及外消旋手性化合物的拆分中，青霉素酰化酶都发挥了关键作用，具有广泛的市场需求和发展前景。随着基因工程和酶工程领域不断创新与发展，研究者构建筛选出产青霉素酰化酶的高产优质基因工程菌，并且将青霉素酰化酶应用于对环境无污染，反应条件温和以及具有绝对专一性的酶法合成中，生产青霉素与头孢菌素类抗生素，与传统的化学合成法相比，可使生产成本减少10％以上。因此，获得高效发酵生产青霉素酰化酶及其固定化、转化的工艺参数，将促进其在医药、食品等产业中的应用。本研究采用重组大肠杆菌为试验菌株，研究其

6、产酶的发酵条件和分批发酵动力学，对青霉素酰化酶的固定化及其催化合成头孢克洛的反应条件进行优化，主要结果如下：摇瓶发酵条件优化结合单因素试验和响应面分析法，对重组大肠杆菌产青霉素酰化酶的摇瓶发酵条件进行了优化。单因素试验确定最适甘油浓度、蛋白胨浓度、诱导物IPTG浓度以及发酵初始pH和发酵初始温度的范围分别为15～20g／L、15～20g／L、50I．tg／mL、6．5-7。5矛u28-36℃。采用Box—Behnken试验设计和响应面分析方法，对重组大肠杆菌产青霉素酰化酶的发酵条件进行优化，得出其最佳发酵条件：甘

7、油浓度为20g／t,，蛋白胨浓度为21g／L，发酵初始pH值为7。l，在此条件下青霉素酰化酶的平均活力达到8425．3lU／L，较优化前提高了11％。发酵动力学模型建立利用5L发酵罐对重组大肠杆菌产青霉素酰化酶的发酵过程进行了放大，根据Logistic方程和Luedeking-piret方程，采用Origin8．0绘图软件对重组大肠杆菌产青霉素酰化酶发酵实验数据进行非线性拟合，建立了分批发酵生产青霉素酰化酶的菌体生长、青霉素酰化酶合成以及基质消耗动力学模型，分别如下：(1)菌体生长动力学模型x=鼎344器7604

8、e．1+7．∽“44“(2)青霉素G酰化酶合成动力学模型肚二zQ：旦!鲨：罢丽+9．8714×In—34．147+7—．604en22442t134．147+7．60匏02244力41．7515(3)基质消耗动力学模型s：24．5。·8一j石三三舌≠辜写貉一0．8688×In三兰』尘堑乇去筹所建模型能够较好模拟了重组大肠杆菌分批发酵产青霉素酰化酶的动态过程，为工业化生产提供了可行的参考依据。青霉素酰化酶固定化条件确定通过实验比较，确定青霉素酰化酶固定化载体为国产胺基型树脂LX．1000HA，单因素试验和Box．B

9、ehnken试验设计相结合，对影响胺基树脂固定化青霉素酰化酶的主要因素进行优化。结果显示最佳固定化条件为：pH7．8、温度25℃、载体用量0．11g／mL、时间24h，在此条件下固定化酶活力达至u]229．78U／g，酶活回收率为61．66％，说明：t冬LX．1000HA型树脂用于重组大肠杆菌产青霉素酰化酶的固定化切实可行。固定化青霉素酰化酶催化合成头孢克洛的反应体系建立