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1、∀156∀国外医药抗生素分册2004年7月第25卷第4期文章编号:1001-8751(2004)04-0156-04青霉素酰化酶:固定化及其应用肖正华张梦军王云霞任建敏夏仕文(第三军医大学医学检验系,重庆400038)摘要:青霉素酰化酶广泛应用于-内酰胺类抗生素中间体和半合成-内酰胺类抗生素的合成。虽然游离酶具有极高的催化活性,但其对温度、pH值、溶剂极性等的耐受范围极窄,极易失活,而且在有机溶剂中发生的失活是不可逆的。为了提高其各方面稳定性,不断有新的固定化方法提出。本文综述了青霉素酰化酶的固定化方法及其应用。关键词:青霉素酰化酶
2、;固定化;交联酶晶体;交联酶聚集体+中图分类号:Q556.4文献标识码:A[3]青霉素酰化酶(PGA)又称为青霉素酰胺酶或青霉究。吸附法虽然操作简便,反应条件温和,但是酶素氨基水解酶,主要是作为大肠埃希氏菌胞内酶和巨和载体的吸附力比较弱,容易在不适宜的条件下解吸大芽胞杆菌胞外酶而获得,在工业上用于大规模生产脱落,因此,必须控制好吸附与操作的条件,开发新的-内酰胺类抗生素中间体和半合成-内酰胺类抗载体是解决这些缺点的重要途径。生素。有研究表明,游离的青霉素酰化酶酶活表达的12共价偶联法优化环境条件为28,0.02mol/L的pH为8.1的磷共
3、价偶联法是通过在酶的非必须侧链基团与载体[1]酸盐缓冲液体系。但由于众所周知的原因,游离酶的功能基团之间形成稳定的共价键,从而达到固定的对环境变化的耐受力极低,这大大限制了它的大规模目的。通过共价偶联得到的固定化酶结合牢固,稳定应用,固定化酶应运而生。固定化酶具有游离酶无法性好,利于连续使用,是目前应用和报道得最多的一类[4]比拟的优势,它对温度、pH值、溶剂极性等具有极高的方法。韩辉等将巨大芽胞杆菌胞外青霉素酰化酶耐受性,并能反复回收使用。自1953年酶固定化方法通过共价键结合到聚合物载体EupergitC颗粒的环氧首次提出以来,人们不断探索新的固定化方法
4、,以期提基团上,成功地获得了高活力的固定化青霉素酰化酶。高酶在各方面的稳定性。从吸附、包埋、共价偶联到交用这种酶水解青霉素的最适pH为8.0,最适温度达到联法,从载体固定到无载体固定,酶的固定化技术不断55,在pH6.0~8.5,温度低于40时固定化酶活力发展。本文从有载体和无载体两个大的方面对青霉素稳定,在使用200批后,活力仍保留80%左右,但这种酰化酶的固定化方法及应用进行评述。酶的缺点是苯乙酸对其抑制增大。1载体固定化化学偶联反应一般比较激烈,为了减少酶在偶联酶固定化方法的提出是酶应用领域的一大飞跃。过程中失活,应采取一些保护措施。如应用可逆抑
5、制不同固定化方法和不同载体制备的各种固定化酶的性剂或底物,封闭或牵制酶的活性中心与必需基团,避免质存在一定的差异。一般来说,酶的固定化方法可概影响酶的活性构型和活性基团。另外,还必须注意酶括为4种类型:吸附法、共价偶联法、交联法和包埋的偶联量,要平衡好单位载体上酶的偶联量与相对酶[2]法。活力!的关系,这对其它类型的固定化方法也具有同样11吸附法重要的意义。吸附法是通过载体表面与酶分子表面间的次级键13载体交联法相互作用而达到固定目的的方法。其又可分为物理吸载体交联法即是利用双功能或多功能试剂在酶分附和离子交换吸附。Chanhan等利用硅藻土作为吸附
6、子与载体间进行交联反应,以共价键制备固定化酶的载体对PGA进行固定,并对其动力学反应进行了研方法。其中应用较多的双功能试剂是戊二醛。鲜海军收稿日期:2004-02-27作者简介:肖正华,男,生于1972年,硕士,主要从事药物控缓释研究。国外医药抗生素分册2004年7月第25卷第4期∀157∀等[5]用酸部分水解丙烯腈纤维为载体,以戊二醛为交[6]质包埋。用聚丙烯酰胺包埋青霉素G酰化酶所得联剂制备了固定化的胞外青霉素G酰化酶。这种固固定化酶对头孢菌素G的最适pH高达9.0,最适温定化酶的活力达到2300U/g,可以将浓度为2.5%~度为50。固定化酶的pH
7、稳定性和热稳定性皆优于12.5%的青霉素G钾盐水解98%以上,其在室温中的游离酶。半衰期竞达130d。15产酶菌的固定交联反应可能发生在酶分子间,也可能发生于酶除了直接对青霉素酰化酶进行固定外,还可对产[7]分子内。通过酶分子间交联形成的固定化酶颗粒一般酶菌进行固定。曹学君等以青霉素酰化酶基因重很小,而且机械性能不佳。为了减少这种分子间或分组大肠埃希氏菌A56(pPA22)经戊二醛交联(防止细子内交联,可先将酶吸附于载体上,或包埋于载体内,胞自溶)后,在PEG20000-DextranT70两水相体系再用双功能试剂进行交联。中进行转化反应生产6-APA,
8、实现了高底物浓度、高14包埋法转化率的6-APA
