临床医学毕业论文顺铂对结肠癌细胞株hct116凋亡及存活素表达的影响.doc

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1、XX大学毕业论文顺钳对结肠癌细胞株HCTPi116凋亡及存活素表达的影响2014年6月25日顺钳对结肠癌细胞株HCT116凋亡及存活素表达的影响作者：陈贻平欧阳范献翁敬飓【摘要】口的探讨结肠癌细胞株HCT116对化疗药物顺钳不嬪感的原因与机制。方法观察不同浓度顺钳（0.1、0.5、1.0、5.0>10.0gg/ml）对HCT116细胞凋亡及低浓度顺钳对抗凋亡基因存活索（survivin）mRNA及蛋白表达的影响，用流式细胞仪检测凋亡率;荧光定量PCR检测survivinmRNA的表达;Western印迹法检测survivin蛋白的表达。结果高浓度（5.0、10pg/

2、ml）顺钠对HCT116细胞有较强促进凋亡作用，而低浓度（0.1、0.5、1.0卩g/ml）顺钳干预24h后，促进细胞凋亡的作用不明显;HCT116细胞在1.0pg/ml顺钳作用下，survivinmRNA及蛋白表达在24h均有明显升高。结论顺钠可诱导HCT116细胞的凋亡，但该细胞对低浓度顺钳不敏感。survivin表达增高可能是HCT116细胞对顺钠细胞毒性药物作用不敏感的原因Z-o【关键词】顺钳;细胞凋亡;存活索结肠癌化疗疗效尚不令人满意，原因主要为癌细胞对化疗药物作用的敏感性差⑴。为此本实验将常用化疗药物顺钠（cisplatin）设为5个不同作用浓度，通过检

3、测HCT116细胞在顺钳作用过程屮的凋亡情况及相关基因存活素（survivin）的表达变化，探讨结肠癌细胞对细胞毒性药物顺钠作用不敏感的原因及可能机制。1材料与方法1.1试剂DMEM>Trizol（Invitrogen公司），胎牛血清（四季青公司）,AnnexinvPI细胞凋亡检测试剂盒、蛋白定量试剂盒、蛋白Marker及ECL发光试剂盒（凯基公司），青链霉素、胰酶（吉诺公司），荧光定量PCR试剂盒（TaKaRa公司），引物均由上海英俊生物技术有限公司合成。survivin抗体（SantaCruz公司）。内参卩actin.辣根过氧化物标记二抗（北京屮山公司）。细胞购

4、于生科院细胞所。顺钳为山东齐鲁制药厂。1.2方法1.2.1细胞培养HCT116细胞用DMEM培养液（含10%胎牛血清，100U/L青霉素,100U/L链霉素），于37°C、5%CO2培养箱屮培养。1.2.2AnnexinVPI检测细胞凋亡收集“105细胞PBS洗涤2次，以200卩1的BindingBuffer悬浮细胞;加入5plAnnexinvFITC混匀，加入5glPI混匀。室温避光15min,流式细胞仪检测。1.2.3Trizol提取细胞的总RNA6孔培养板每孔屮加入1ml的Trizol裂解细胞，反复吹打3min后将细胞裂解物移入1.5ml的EP管内。静置5mi

5、n,每1ml的Trizol加0.2ml氯仿，盖紧样品管盖，用力摇晃EP管15s并将其置于室温卜孵育5min。4°C4200r/min冷冻离心15min。将水样层移至一^干净的EP管屮，加入等体积的异内醇，混合后将样站在冰盒上放置30min使RNA析出，4°C4200r/min的离心力高速冷冻离心10min。移去上层悬液，用1ml75%乙醇再洗涤RNA1次，将75%乙醇移去，简单干燥RNA沉淀，用无RNA卿水溶解RNA,并在56°C孵育5mine1:50稀释测定浓度，样品保存于-80°01.2.4RTPCR检测survivinmRNA的表达引物序列为survivin

6、上游:5，TTCGTCCGGTTGCGCTTTCC3’5'TCGATGGCACGGCGCACTTT3：卩actin5’TGGCACCACACCTTCTACAAT3'5，AGAGGCGTACAGGGATAGCA3，。反应体系使用TaKaRa公司试剂盒，反转录反应条件42°C15min;85°C5s;RTPCR反应条件95°C10s,1个循环;95°C5s,60°C20s,45个循环。F(Fold)=2△△CT,△△CT=(CT.TargetCT.Actin)treated-(CT.TargetCT.Actin)control□1.2.5全细胞蛋口提取冰预冷的PBS轻轻

7、洗涤瓶屮贴壁的细胞，6孔培养板每孔屮加入100卩1细胞裂解液融解细胞，同时用细胞刮子收集细胞，以上在冰上操作;细胞裂解液进行离心沉淀，取上清测其总蛋白浓度，剩余冻存于・70°C待用。1.2.6Western印迹检测survivin蛋口的表达提取总蛋白进彳亍SDS聚内烯酰胺琼脂糖凝胶屯泳，转膜，5%脱脂奶粉封闭2h,—•抗4°C孵育过夜，TBST洗膜5minx4,二抗室温孵育1h,ECL发光试剂盒显色，曝光。1.3统计学方法数据均采用SPSS11.5软件进行统计学分析，计量资料以x土s表示，多组间的均数比较采用onewayANOVAo2结果2」顺钳对HCT116凋